组织因子表达与卵巢癌肿瘤微环境中免疫细胞浸润模式的相关性研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Tissue Factor Expression Is Associated with Distinct Pattern of Immune-Cell Infiltration in the Ovarian Tumor Microenvironment

组织因子（tissue factor, TF）已被认为与肿瘤进展和免疫调节有关，但其在卵巢癌中的细胞来源及其与免疫浸润的关系尚未完全明确。研究人员整合了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq，数据集GSE232314）、癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）卵巢癌队列分析，以及在独立25例组织微阵列（tissue microarray, TMA）上的多重免疫荧光检测。单细胞分析显示，TF表达集中于肿瘤上皮细胞和一个独立的血管内皮细胞亚群，在免疫细胞及其他基质成分中表达极低。在TCGA队列中，TF表达与肿瘤分期、分级、无病生存期（disease-free survival, DFS）或总生存期（overall survival, OS）均无显著关联。然而，在按TF分层的分析中，高CD8⁺ T细胞浸润在低TF表达亚组中与较好生存相关（风险比[hazard ratio, HR] = 0.60），但在高TF亚组中与较差生存相关（HR = 1.72）；高M1巨噬细胞浸润仅在低TF亚组中与较好生存相关。TF表达与估计的CD8⁺ T细胞、记忆B细胞和M1巨噬细胞浸润呈负相关，与初始B细胞浸润呈正相关。在TMA队列中，高TF肿瘤表现出显著更低的CD56⁺ NK细胞和CD68⁺巨噬细胞浸润，以及更低的CD68/CD163比值。综合来看，这些发现显示了TF表达与若干抗肿瘤免疫群体测量丰度降低之间的横断面关联，以及CD8⁺ T细胞浸润与生存之间依赖于TF分层的关联。这些关联在转录组学（TCGA）和蛋白质水平（TMA）队列之间并不完全一致，需要前瞻性、经正式检验的验证。TF作为卵巢癌中一种候选免疫背景生物标志物，值得进一步研究。

**1. 研究背景与目的**

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤之一，其中高级别浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian carcinoma, HGSOC）因高度分子异质性和复杂的肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME），患者长期预后差。组织因子（tissue factor, TF）作为外源性凝血级联的主要启动因子，除止血功能外，还参与血管生成、肿瘤生长、转移和炎症调控。TF在多种癌症中异常高表达，并通过与凝血因子及蛋白酶激活受体（protease-activated receptors, PARs）相互作用，激活涉及增殖、迁移和免疫调节的信号通路。既往研究提示，TF过度表达可促进肿瘤免疫逃逸，并与“冷”免疫抑制微环境相关。然而，TF在卵巢癌TME中的主要细胞来源，及其与抗肿瘤免疫细胞浸润的关系尚不完全清楚，TF表达本身是否与生存直接相关，或是否通过改变免疫背景间接影响预后，也缺乏系统研究。

为此，研究人员整合了单细胞转录组分析、基于TCGA的临床病理与生存分析、CIBERSORT免疫反卷积，以及独立TMA的多重免疫荧光检测，旨在明确TF在卵巢癌中的细胞分布，评估其与临床病理特征、生存及免疫细胞浸润的关联，并探讨TF作为免疫相关生物标志物和潜在治疗靶点的合理性。

**2. 研究内容、结论与意义**

研究人员利用公共单细胞数据集GSE232314、TCGA卵巢癌队列以及独立的多重免疫荧光TMA队列，从转录组和蛋白质水平系统描绘了TF的表达特征及其与免疫微环境的关系。结果显示，TF表达集中于肿瘤上皮细胞和特定内皮细胞亚群，与分期、分级及总体生存无显著直接关联；但TF表达与CD8⁺ T细胞、记忆B细胞和M1巨噬细胞浸润呈负相关，且在不同TF分层中，CD8⁺ T细胞和M1巨噬细胞浸润表现出相反的预后关联。TMA验证显示高TF肿瘤中NK细胞和CD68⁺巨噬细胞浸润降低。这些发现提示TF可能作为肿瘤免疫背景的候选标志物，但其临床应用仍需前瞻性验证和机制研究支持。

**3. 关键技术方法概述**

研究人员使用了以下主要技术方法：①单细胞RNA测序数据分析，采用GSE232314数据集（来源于2例高级别浆液性卵巢癌患者的4个样本，包括CD45阴性和CD45阳性流式分选组分），经质量控制、DoubletFinder去双细胞、Seurat v5.0聚类和UMAP可视化，注释细胞类型并定位TF表达；②TCGA-OV队列（n=302/303）转录组与临床数据分析，利用UALCAN和GEPIA2平台进行分期、分级比较及Kaplan-Meier生存分析；③CIBERSORT/TIMER2.0反卷积，估计六种免疫细胞亚群的浸润丰度，并进行TF分层生存分析和Spearman相关性分析；④独立25例卵巢癌TMA（OV1003，含22例浆液性、2例黏液性、1例子宫内膜样腺癌）的多重免疫荧光染色，检测TF及CD3、CD56、CD20、CD68、CD163标记，并使用QuPath进行定量分析。

**4. 主要研究结果**

**4.1 单细胞转录组分析鉴定肿瘤上皮细胞和内皮细胞为卵巢癌TF表达的主要细胞来源**

对GSE232314单细胞数据进行UMAP聚类，分辨出肿瘤上皮细胞（两个亚群）、成纤维细胞、内皮细胞（两个亚群）、巨噬细胞（两个亚群）、T细胞、B细胞、NK细胞、癌症相关成纤维细胞、间皮细胞、树突状细胞、浆细胞、增殖期肿瘤细胞及其他髓系细胞。TF表达集中于肿瘤上皮细胞和Endothelial_2亚群，其他基质和免疫细胞中表达极低。TF高状态相关基因富集于核糖核蛋白复合物、核糖体生物发生、rRNA加工、DNA复制等通路，基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）还显示MHC II类抗原呈递和RNA剪接通路富集。

**4.2 TCGA队列中TF表达与分期、分级或生存无显著关联**

TCGA卵巢癌队列中，TF表达在不同肿瘤分期和病理分级间无统计学显著差异。以中位数将患者分为低、高TF组后，两组间的无病生存期（HR = 0.87, log-rank p = 0.26）和总生存期（HR = 0.89, log-rank p = 0.37）均无显著差异。

**4.3 TF分层分析显示CD8⁺ T细胞和M1巨噬细胞浸润的不同预后关联**

按TF表达中位数和CIBERSORT估计的免疫细胞丰度中位数将患者分为四组进行分层生存分析。在低TF亚组中，高CD8⁺ T细胞浸润与更好的生存相关（HR = 0.60, p = 0.0147）；而在高TF亚组中，高CD8⁺ T细胞浸润与更差的生存相关（HR = 1.72, p = 0.012）。高M1巨噬细胞浸润仅在低TF亚组中与较好生存相关（HR = 0.52, p = 0.00195），在高TF亚组中未观察到显著关联（HR = 0.838, p = 0.408）。该部分为探索性分析，未进行多重检验校正。

**4.4 TF表达与特定免疫细胞浸润的估计丰度存在选择性相关**

Spearman相关分析显示，TF表达与CD8⁺ T细胞（ρ = ?0.17, p = 7.17 × 10^?3）、记忆B细胞（ρ = ?0.239, p = 1.39 × 10^?4）和M1巨噬细胞（ρ = ?0.197, p = 1.78 × 10^?3）浸润呈弱负相关，与初始B细胞浸润呈正相关（ρ = 0.304, p = 9.62 × 10^?7）。TF表达还与免疫检查点基因PD-L1（R = 0.15）、CTLA4（R = 0.15）和TIM-3（R = 0.25）呈显著正相关，其中与TIM-3的相关性最强。

**4.5 TMA分析证实TF表达异质性，但与分期或分级无显著关联**

25例卵巢癌TMA队列中，TF蛋白表达呈高度异质性，但不同分级（2级 vs 3级）和分期（I–II期 vs III期）间的TF阳性率差异无统计学意义。

**4.6 多重免疫荧光显示TF与免疫细胞标志物的异质性空间分布**

多重免疫荧光显示，CD56⁺ NK细胞形成离散簇状分布，CD3⁺ T细胞和CD68⁺/CD163⁺巨噬细胞常沿基质区域分布。热图分析显示各病例间TF及免疫标志物阳性率存在显著异质性，且大多数组织芯中CD3⁺ T细胞和CD163⁺巨噬细胞较CD20⁺ B细胞或CD56⁺ NK细胞更丰富。

**4.7 高TF表达与NK细胞和CD68⁺巨噬细胞浸润降低及CD68/CD163比值降低相关**

按TF中位数分组后，高TF肿瘤中CD56⁺ NK细胞和CD68⁺巨噬细胞比例显著降低，CD68/CD163比值亦显著降低（Mann-Whitney U检验，p < 0.05），而CD3⁺、CD20⁺和CD163⁺细胞比例无显著差异。连续变量相关性分析亦证实TF表达与CD56⁺细胞（r = ?0.4267, p = 0.0334）、CD68⁺细胞（r = ?0.5071, p = 0.0097）及CD68/CD163比值（r = ?0.5862, p = 0.0021）显著负相关。

**5. 讨论总结与研究结论**

讨论部分指出，TF主要表达于肿瘤上皮细胞和特定内皮细胞亚群，与既往研究相符。虽然TF单独与预后无显著关联，但CD8⁺ T细胞和M1巨噬细胞在不同TF分层中呈现相反的预后模式，提示TF可能标记了免疫效应细胞功能受损的肿瘤微环境。TMA中高TF肿瘤的NK和CD68⁺巨噬细胞减少与凝血激活抑制免疫的机制假说一致，但该假说需实验验证。TCGA与TMA结果的不完全一致性主要源于两种平台测量层面不同：CIBERSORT基于转录组功能签名，而TMA使用谱系标记，无法区分CD8与CD4、静息与活化NK、M1与M2巨噬细胞。研究局限性包括样本量小、未校正多重比较、未进行正式交互检验以及缺乏功能验证。

研究结论可翻译为：总之，卵巢癌中的TF表达集中于肿瘤上皮细胞和特定的内皮细胞亚群。尽管TF表达本身与分期、分级、无病生存期或总生存期无显著关联，但它与更低的CD8⁺ T细胞、记忆B细胞和M1巨噬细胞浸润估计值相关，并且与CD8⁺ T细胞和M1巨噬细胞预后关联的TF分层特异性模式相关。独立的TMA分析进一步将高TF表达与更低的CD56⁺ NK细胞和CD68⁺巨噬细胞浸润及更低的CD68/CD163比值相关联。这些发现虽然在转录组和蛋白质水平队列的具体细节上并非完全一致，但共同支持TF作为肿瘤免疫环境的候选标志物。在TF被确立为卵巢癌的免疫相关生物标志物之前，需要开展前瞻性验证、正式的交互分析及机制研究。