《International Journal of Molecular Sciences》：Harnessing Neurogenic Potential of Glial Cell Types as an Emerging Strategy for Treating Epilepsy
编辑推荐：
约三分之一的癫痫病例对抗癫痫药物无效，因此针对该疾病新疗法的探索仍在持续。近年来，研究者已设计出多种新方法，用于在脑内原位生成具有所需特性的细胞，以及在特定细胞类型中实现基因的靶向表达。这些方法使研究者得以考虑在癫痫等病理条件下将脑内常驻胶质细胞转化为神经元的
约三分之一的癫痫病例对抗癫痫药物无效，因此针对该疾病新疗法的探索仍在持续。近年来，研究者已设计出多种新方法，用于在脑内原位生成具有所需特性的细胞，以及在特定细胞类型中实现基因的靶向表达。这些方法使研究者得以考虑在癫痫等病理条件下将脑内常驻胶质细胞转化为神经元的设想；在此类疾病中，该策略有望同时挽救神经元丢失并改善胶质增生。本综述描述了癫痫相关的胶质细胞病理变化、不同类型胶质细胞的神经源性潜能（其与神经干细胞的相似性及其在脑损伤响应中固有的有限产生神经元的能力），以及以不同细胞类型为起点（与神经元谱系距离各异）的现有神经元转分化方法。基于上述主题之间的交叉，研究人员就胶质细胞向神经元转化在癫痫治疗中的适用性，以及在该策略的实验设计和临床试验中应考虑的最重要挑战得出了结论。
论文主体内容总结
1. 引言
癫痫是最常见的神经系统疾病之一，全球约有5000万患者。癫痫发作是由脑内异常过度或同步的神经元活动引起的短暂行为改变。颞叶癫痫（TLE）因其对抗癫痫药物耐受而常需手术干预，受到研究者特别关注。癫痫发作是神经元环路兴奋/抑制平衡破坏的结果，其细胞层面机制通常涉及离子通道功能改变和/或谷氨酸能与GABA能突触传递失衡。值得注意的是，仅一小部分神经元发生突变即可诱发癫痫发作。然而，现有抗癫痫药物仅能控制发作，不能消除脑内潜在的病理变化，且约三分之一的病例为药物难治性。近年来，胶质细胞在癫痫发病中的作用日益受到重视。国际抗癫痫联盟（ILAE）与国际癫痫局（IBE）已将评估靶向胶质细胞功能的治疗潜力列入癫痫研究优先事项。四大主要胶质细胞类型为星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质前体细胞（OPCs）。近年来，细胞生成方法的进展使研究者能够考虑以转化细胞替代丢失神经元（尤其是GABA能神经元）的癫痫治疗策略。本综述重点讨论利用脑内常驻胶质细胞原位转化为神经元的方法，该策略可避免细胞移植的并发症。
2. 反应性胶质增生及其与癫痫相关的特征；胶质在癫痫发生中的作用
2.1 反应性星形胶质细胞；反应性星形胶质增生的异质性
胶质增生是胶质细胞（尤其是星形胶质细胞和小胶质细胞）对多种中枢神经系统（CNS）损伤的普遍反应。血脑屏障（BBB）损伤导致血清白蛋白、外周免疫细胞和趋化因子外渗至脑实质，与胶质细胞相互作用并诱导胶质增生。反应性星形胶质增生具有不同严重程度分级：轻至中度时仅出现基因表达改变（尤其是GFAP上调）和细胞形态改变（星形胶质细胞胞体和突起肥大）；重度弥漫性反应性星形胶质增生时星形胶质细胞增殖，突起重叠，可能导致组织结构的不可逆重组；伴有致密胶质瘢痕形成的重度反应性星形胶质增生则形成围绕严重组织损伤区域的致密边界。研究表明，在无胶质瘢痕形成时，反应性星形胶质细胞的增殖实际上非常有限。星形胶质细胞对损伤的反应存在异质性，包括肥大、极化和增殖等不同状态。在基因表达和功能层面，反应性星形胶质增生具有更复杂的异质性，不同损伤类型诱导的反应性星形胶质细胞表型差异显著。研究者曾提出A1（有害）和A2（有益）表型分类，但该分类因过于简化而未获普遍接受。在癫痫中，TLE患者星形胶质细胞存在多个亚群，表达不同标记物。
2.2 反应性小胶质细胞
小胶质细胞对脑损伤的激活反应包括细胞形态和基因表达的复杂变化。活化的小胶质细胞呈阿米巴样形态，产生细胞因子和补体蛋白等炎症介质。短期炎症可通过吸引小胶质细胞吞噬受损细胞而促进神经保护，而长期炎症则与包括癫痫在内的病理后果相关。小胶质细胞可采用多种激活状态，其最简单的分类包括M1（经典）和M2（替代）表型。M1极化小胶质细胞表达促炎细胞因子和关键吞噬标记物，M2极化小胶质细胞被认为具有修复和神经保护作用。小胶质细胞可同时表达M1和M2标记物。小胶质细胞不仅参与炎症过程，还在完整脑中具有调节神经环路形成和维持以及神经源性级联稳态的功能。
2.3 癫痫中的反应性胶质增生及伴随的组织病理学改变
反应性星形胶质增生在癫痫手术标本中始终可见。在9523例患者的大规模组织病理学研究中，36.4%的患者存在海马硬化，23.6%存在肿瘤，19.8%存在皮质发育畸形，4.9%存在胶质瘢痕。在癫痫患者新皮质中，星形胶质细胞通常在BBB或血-脑脊液（CSF）屏障处被激活。在TLE脑样本中，海马CA1和CA3区GFAP阳性反应性星形胶质细胞数量增加。海马硬化（HS）是与内侧颞叶癫痫（MTLE）特别相关的组织病理学改变，以神经元丢失和以锥体细胞层为中心的慢性纤维性胶质增生为特征。硬化海马中神经元丢失超过50%，胶质密度较非硬化海马增加约80%。HS中可见颗粒细胞弥散、苔藓纤维出芽及中间神经元改变。颗粒细胞弥散和苔藓纤维出芽与成人海马神经发生异常相关。手术切除硬化海马可使约85%的患者获得良好的发作控制。
2.4 癫痫中星形胶质细胞和小胶质细胞在分子水平的病理变化：胶质细胞促进癫痫发生的机制
反应性星形胶质增生是癫痫灶的标志。星形胶质增生可能不仅是癫痫发作的后果，也可能是其原因。在TBI相关癫痫中，胶质增生先于癫痫发展，因此可能是致病性的。癫痫中星形胶质细胞的反应性伴随动态的转录组和分子变化。在MTLE患者星形胶质细胞中，GFAP、连接蛋白43、电压门控Na+和Ca2+通道、GABA转运体GAT3上调；水通道蛋白4（AQP4）上调并错误定位；谷氨酸转运体EAAT1和GLT1、内向整流K+通道Kir4.1及谷氨酰胺合成酶表达下降。转录组学研究鉴定出九个癫痫相关星形胶质细胞特异性枢纽基因：YAP1、AQP4、GJA1、NOTCH2、GFAP、ERBB2、ITGAV、LRP1和ABCA1。
2.4.1 神经炎症
在神经炎症中，小胶质细胞的贡献至关重要，但星形胶质细胞的变化与小胶质细胞密切相关。小胶质细胞和星形胶质细胞通过释放信号分子建立复杂的双向通讯。癫痫神经炎症中涉及的小胶质细胞-星形胶质细胞串扰分子包括促炎细胞因子（IL1α、TNFα、HMGB1、CXCL10）、补体成分（C1q、C3）等。胶质免疫炎症功能失调是导致神经元过度兴奋和癫痫发作的常见因素。癫痫发作和神经炎症形成恶性正反馈循环。补体成分C1q和C3在神经炎症中发挥重要作用，补体依赖性小胶质细胞突触吞噬是发育中脑突触消除的核心机制。在难治性癫痫患者脑样本中已显示C1q和C3水平升高。一些抗炎药物已在临床试验中对某些类型癫痫显示出有希望的结果。
2.4.2 癫痫脑中小胶质细胞的其他变化
在癫痫动物模型中，M1和M2标记物的表达因模型而异；在毛果芸香碱和海人藻酸模型中，SE诱导后不久M1标记物上调，而小胶质细胞激活在早期慢性期基本恢复至对照水平。小胶质细胞的激活可调节兴奋性突触的活性。小胶质细胞激活涉及ATP的快速产生和释放，细胞外ATP与星形胶质细胞上的P2Y1R受体结合，触发星形胶质细胞释放谷氨酸和更多ATP。若兴奋与抑制之间的平衡受损，这种小胶质细胞对突触活性的调节可能足以增加癫痫样波的产生概率。
2.4.3 星形胶质细胞谷氨酸清除障碍
正常情况下，星形胶质细胞通过转运体EAAT1和EAAT2清除突触间隙多余的谷氨酸，将其转化为谷氨酰胺。星形胶质细胞调节谷氨酸和GABA的循环，谷氨酸-谷氨酰胺循环的破坏可能导致癫痫发生。在MTLE患者（均伴有HS）的手术切除脑样本中，谷氨酰胺合成酶（GS）免疫反应性降低，GS的丢失在星形胶质细胞增殖区域尤为明显。在伴有HS的TLE样本中GS免疫反应性降低，但在无HS的TLE样本中与对照相似，表明GS下调并非癫痫发作的简单后果。
2.4.4 星形胶质细胞钾清除和水转运障碍
星形胶质细胞通过Na+/K+-ATP酶、Na-K-Cl共转运体和内向整流钾通道（Kir）参与细胞外K+浓度的恢复。星形胶质细胞Kir通道（尤其是Kir4.1）的下调或功能障碍已在某些类型癫痫和癫痫模型中发现，可能是癫痫活动的致病因素。星形胶质细胞缝隙连接耦联在MTLE伴HS患者脑标本中完全缺失。AQP4是星形胶质细胞高表达的水通道蛋白，与Kir4.1在星形胶质细胞终足中共定位。AQP4表达变化已在动物和人类癫痫中观察到，AQP4的错误定位即使未丢失表达也会导致K+清除障碍。
2.4.5 胶质递质传递异常
星形胶质细胞的正常功能之一是谷氨酸释放，通过该机制控制突触网络的兴奋性、可塑性和同步活动。星形胶质细胞VGlut1依赖性谷氨酸信号具有抗癫痫作用。谷氨酸摄取可导致星形胶质细胞通过GABA转运体逆转释放GABA，这种谷氨酸/GABA交换在持续兴奋期间对CA1锥体细胞的紧张性抑制有显著贡献，可被视为适应性神经保护机制。星形胶质细胞通过Bestrophin-1（Best1）通道释放GABA对维持兴奋/抑制平衡至关重要。腺苷是内源性抗惊厥剂和癫痫终止因子，其细胞外水平主要由星形胶质细胞腺苷激酶（ADK）控制。癫痫发生过程中ADK呈双相表达变化，星形胶质增生与ADK表达增加和腺苷缺乏相关。通过基因治疗纠正星形胶质细胞腺苷传递在啮齿动物实验中已显示有效。
2.4.6 反应性星形胶质细胞的细胞外基质重塑
神经ECM的主要成分由神经元和胶质细胞合成。在病理条件下，反应性星形胶质细胞过量产生某些ECM分子，造成生长不利环境和突触可塑性受损。另一方面，ECM分子降解导致周围神经元网（PNNs）不稳定，可能引起不受控制的出芽和突触发生，而异常突触发生是癫痫的特征。在癫痫动物模型和人类癫痫组织中已报道ECM和PNNs的病理性重塑以及MMP水平上调。PNN异常导致中间神经元选择性丢失的癫痫病例中，转分化治疗可能有用，因为许多现有转分化方法主要产生GABA能中间神经元。
2.4.7 星形胶质细胞葡萄糖和脂质代谢改变
神经元具有高氧化活性，而星形胶质细胞以糖酵解为主并能储存糖原。星形胶质细胞中的糖酵解和糖原分解产生乳酸，乳酸被转移至神经元作为线粒体能量底物。在癫痫中，星形胶质细胞对维持癫痫样活动至关重要。TLE患者海马中已发现糖原水平增加。癫痫发作与细胞外谷氨酸增加相关，星形胶质细胞摄取谷氨酸刺激星形胶质细胞糖酵解。乳酸脱氢酶（LDH）抑制剂可减少癫痫发作和癫痫样活动。单羧酸转运体1（MCT1）在三种不同TLE大鼠模型的海马形成区星形胶质细胞上过表达。脑内乳酸还具有信号传导功能，可通过与羟基羧酸受体1（HCAR1）相互作用负性调节神经元兴奋性。在TLE患者和KA诱导癫痫小鼠的癫痫灶中观察到神经元和星形胶质细胞中脂滴形成增加。转录组分析显示TLE中星形胶质细胞的脂质转运和代谢相关通路激活比神经元更为显著。APOE是TLE参与者与对照之间星形胶质细胞中差异表达最大的基因之一。脂质积累反应性星形胶质细胞（LARAs）亚群显示脂质转运相关通路特别富集。APOE是星形胶质细胞脂质积累所必需的，星形胶质细胞特异性Apoe敲除减少了KA处理小鼠的癫痫活动和神经元丢失。
2.5 放射状胶质样神经干细胞、成人神经发生与癫痫
放射状胶质（RG）是仅存在于发育中神经系统的细胞类型。与RG相似的祖细胞（放射状胶质样细胞，RGLCs）在成年哺乳动物CNS的某些区域作为神经干细胞（NSCs）发挥作用。NSCs在表型上与星形胶质细胞相似，不仅表达某些蛋白质，还具有超微结构特征。NSCs可能执行支持神经元和突触活动的典型星形胶质细胞功能。当NSCs停止产生新神经元时，它们可能终末分化为星形胶质细胞。NSCs与星形胶质细胞的相似性可能导致混淆，但最近的转录组研究证据表明成年NSCs不应被归类为星形胶质细胞。成年NSCs在啮齿动物中已在SGZ和SVZ两个经典神经发生龛中得到了最充分的描述。在癫痫中，SGZ通常是关注的区域，因为它位于海马中。在啮齿动物癫痫模型中，急性和轻度癫痫发作后成人海马神经发生增加，但慢性和严重癫痫则减少。癫痫发作改变NSC特性，SE后NSCs顶端突起数量减少，突起向门区延伸，约半数细胞开始表达S100β，提示向星形胶质细胞分化的转变。癫痫后出生的新神经元表现出异常特性，未能整合到对记忆形成重要的海马环路中，并通过不同机制增加整体网络兴奋性。使用细胞类型特异性遗传方法消除神经发生可长期减少自发性反复发作频率并挽救癫痫动物的认知缺陷。NSCs天然产生神经元，将其移植至受损脑区可能足以用于细胞治疗，但存在获取自体NSCs困难、移植NSCs在促炎微环境中存活率低以及肿瘤形成风险等障碍。
2.6 少突胶质前体细胞及其在癫痫中的病理变化
少突胶质前体细胞表达神经/胶质抗原2（NG2），也称为NG2阳性胶质细胞。OPCs占CNS所有细胞的2-8%，是主要增殖细胞类型。OPCs分布于灰质和白质中，在成熟脑中均匀分布。OPCs是自我更新的常驻祖细胞，终生保持增殖能力，主要功能是产生少突胶质细胞，但也可产生星形胶质细胞。OPCs表达多种离子通道和神经递质受体，与神经元（包括突触）、其他胶质细胞类型、内皮细胞和周细胞建立物理接触。OPCs接受谷氨酸能和GABA能突触接触。OPCs参与神经环路细化，通过吞噬突触前输入。存在电生理上不同的OPC类型：有放电型和无放电型OPCs，仅放电型OPCs表达电压门控Na+和K+通道并接受神经元突触输入。OPCs对急性CNS损伤的反应包括向损伤部位迁移、增殖增加、NG2表达增加和形态改变。在癫痫中，毛果芸香碱诱导的小鼠癫痫中海马CA1、CA3和DG区OPCs数量在SE后1天至2个月增加。锂-毛果芸香碱诱导的癫痫大鼠海马中观察到髓鞘和少突胶质细胞丢失，OPCs数量增加并增殖，OPCs数量和增殖OPCs比例在癫痫发生的潜伏期达到峰值，在慢性期下降。难治性癫痫患者癫痫灶中MBP和其他髓鞘相关蛋白水平降低，OPCs和前少突胶质细胞数量增加，而幼稚和成熟少突胶质细胞数量减少。这些报告提示癫痫发生可能促进OPC增殖，同时损害其分化为成熟少突胶质细胞的能力，这可能是癫痫中有时观察到的脱髓鞘的原因之一。
3. 胶质细胞的神经源性潜能；利用胶质细胞产生神经元的论据及追踪新神经元起源的方法
即使CNS中最早的祖细胞（神经上皮细胞和RG）在体内和原代培养中通常也只产生单一类型的后代。在体外仅在生长因子暴露下（如神经球培养条件）观察到多能性。脑实质中具有神经球形成能力的细胞很少。脑损伤可通过不同机制诱导代偿性神经发生，但这些机制效果有限，哺乳动物脑再生能力非常有限，大多数新产生的成神经细胞不能存活。谱系追踪是细胞分化或转分化研究中的关键方法学概念，包括在细胞属于起始细胞类型时标记单个细胞，并在其转化和可能的形态和/或增殖改变后保持标记。可使用转基因小鼠品系进行遗传追踪，也可使用病毒追踪。
3.1 星形胶质细胞的神经源性潜能及其与神经干细胞的相似性
在细胞重编程研究中，星形胶质细胞因其分裂能力、在脑中的丰度以及与神经元的谱系距离较近，可能被视为原位生成新神经元的理想起始细胞类型。有证据表明星形胶质细胞（或被鉴定为星形胶质细胞的细胞）在体外和体内即使没有特定操作也能产生神经元。在某些条件下，星形胶质细胞可表达神经源性程序，经历成年神经发生龛中NSCs的典型阶段：激活后产生ASCL阳性瞬时扩增祖细胞（TAPs），进而产生DCX阳性成神经细胞。
3.1.1 健康脑中星形胶质细胞的神经发生
星形胶质细胞与NSCs之间的相似程度很高，以至于在旨在操纵星形胶质细胞以促进CNS再生的实验中，准确鉴定星形胶质细胞成为技术挑战。单细胞转录组分析显示星形胶质细胞和不同激活阶段的NSCs属于同一连续体，静止（不增殖）NSCs在基因表达谱上与星形胶质细胞非常相似。在小鼠胚胎和出生后早期发育阶段，不同CNS区域的星形胶质细胞具有某些干细胞特性：体外高达10%的此类星形胶质细胞可形成能产生神经元和胶质细胞的神经球。即使完全分化的星形胶质细胞也具有显著的转录组和生理可塑性。
3.1.2 损伤诱导的星形胶质细胞神经发生
脑损伤可诱导星形胶质细胞获得神经源性特性。在多种损伤模型中观察到星形胶质细胞去分化并产生神经元。然而，不同损伤类型诱导的星形胶质细胞神经发生能力不同，侵入性损伤（如穿刺伤）可诱导星形胶质细胞增殖，而淀粉样斑块等病理则不能。损伤诱导的星形胶质细胞神经发生效率较低，产生的神经元数量有限，且大多数新产生的神经元不能长期存活。
3.2 OPCs的神经源性潜能
关于OPCs产生神经元的能力存在争议性数据。一些体外研究表明OPCs可产生神经元，但体内证据有限且存在争议。在脑损伤条件下，OPCs的神经源性潜能可能被激活，但该过程的效率和生理意义尚不明确。
4. 神经元转分化方法
4.1 转分化过程中的细胞变化
胶质细胞向神经元转分化涉及细胞身份的根本改变，包括基因表达程序的全面重编程、细胞形态改变、线粒体形态和基因表达变化以及代谢从糖酵解向氧化磷酸化的转换。转分化过程中大量细胞因氧化应激而死亡，在细胞线粒体变得类似神经元且对其脆弱性降低之前即死亡。
4.2-4.10 不同起始细胞类型的转分化方法
现有转分化方法以不同细胞类型为起点，包括星形胶质细胞、OPCs、小胶质细胞等，使用不同的神经源性转录因子（TFs）如Ascl1、NeuroD1、Dlx2等，通过病毒载体表达或药物诱导实现。不同方法的效率、产生的神经元亚型和安全性各有差异。
5. 癫痫模型中的胶质细胞向神经元转化
目前将癫痫模型与胶质细胞向神经元转化结合使用的已发表实验论文很少。现有间接证据支持继续研究基于转分化的癫痫治疗策略。
6. 讨论
6.1 反应性星形胶质细胞作为转分化靶点的优势
反应性星形胶质细胞是转分化治疗的优选起始细胞类型；与静息星形胶质细胞相比，反应性星形胶质细胞即使无需额外处理也可能启动神经源性程序，且对施加的神经源性因子更敏感。
6.2 GABA能神经元生成
许多现有转分化方法主要产生GABA能中间神经元，这有利于恢复癫痫中受损的兴奋/抑制平衡。
6.3 炎症环境的影响
抗炎治疗可增加预先存在的神经元和NSCs的存活，但也可能通过减少对重编程更敏感的反应性星形胶质细胞数量而阻碍星形胶质细胞向神经元转化治疗。
6.4 转分化效率与细胞存活
转分化产生的诱导神经元（iNs）数量少于处理的胶质细胞数量；部分细胞未完成转分化过程，发生细胞死亡或恢复其胶质身份。氧化应激是限制转分化细胞存活的重要因素。
6.5 病理环路重塑的障碍
HS中的病理性环路重塑（如苔藓纤维出芽）可能对iNs的正确整合构成障碍。
7. 结论
基于胶质细胞神经源性潜能的癫痫治疗策略具有理论可行性，但面临诸多挑战，包括转分化效率、细胞存活、iNs的功能整合、安全性以及癫痫脑内复杂病理环境的干扰。在设计实验和临床试验时应充分考虑这些挑战。
