《International Journal of Molecular Sciences》：Single-Molecule Nanopore Sequencing of the TERT Core Promoter CpG Island Reveals PQS-Associated Strand Asymmetry of De Novo Methylation and Its Modulation by Photo-Oxidation
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人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）启动子的DNA甲基化参与癌症中端粒酶调控。研究人员检查了链身份和序列背景如何与Dnmt3a催化结构域（Dnmt3a catalytic domain,
人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）启动子的DNA甲基化参与癌症中端粒酶调控。研究人员检查了链身份和序列背景如何与Dnmt3a催化结构域（Dnmt3a catalytic domain, Dnmt3a-CD）介导的甲基化相关。链分辨纳米孔测序比较了扩增子和质粒中的四种启动子变体（野生型、C228T、C250T和C228T/C250T）。扩增子还在甲基化前用亚甲蓝进行光氧化。胞嘧啶富集链上的甲基化高于鸟嘌呤富集链。限定的推定四链体形成序列（putative quadruplex-forming sequence, PQS）核心显示链不对称性降低和位点间变异降低；按高G4Hunter评分对位点分组未重现该模式。变体和质粒底物在很大程度上保留了空间谱。光氧化扩增子显示测量的5mC（5-methylcytosine，5-甲基胞嘧啶）较低，尤其在鸟嘌呤富集链上，同时广泛保留该谱。光氧化降低了测序质量。对Raji DNA的C富集链进行亚硫酸氢盐分析，在Dnmt3a-CD处理DNA和未处理等分试样中均发现PQS相关的低甲基化谷。总之，这些结果强调了PQS序列背景对hTERT启动子甲基化的重要性，以及准确测序鸟嘌呤富集、易氧化DNA的挑战。
研究背景方面，hTERT（human telomerase reverse transcriptase，人端粒酶逆转录酶）编码端粒酶催化亚基并设定细胞复制极限，其再激活是癌症近乎普遍步骤。hTERT表达部分受其启动子DNA甲基化控制，也受复发性核心启动子突变控制，最常见为C228T和C250T，也称?124C>T和?146C>T。这些突变在多种癌症中被鉴定为关键端粒酶激活事件，并产生ETS家族转录因子结合基序，随后GA结合蛋白GABP被募集到突变启动子并激活转录。甲基化改变和热点突变均与端粒酶再激活和细胞永生化密切相关。遗传和表观遗传变异是肿瘤内异质性互补部分。TERT启动子突变与等位基因特异表观遗传状态相关：表达突变等位基因可相对转录沉默等位基因低甲基化，且甲基化与表达关系取决于所检查启动子区域。hTERT核心启动子异常富G，含多个在限定条件下可折叠成G4（G-quadruplex，G-四链体）的序列，即PQS（putative quadruplex-forming sequence，推定四链体形成序列）。一个延伸68-nt区域含三个PQS并携带C228T和C250T突变。氧化DNA损伤增加序列背景与甲基化关系维度；亚甲蓝光敏化双链DNA产生鸟嘌呤损伤，8-oxoG（8-oxo-7,8-dihydroguanine，8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤）预期占主导。从头甲基化由DNMT3家族包括DNMT3A和DNMT3B执行；Dnmt3a催化结构域（Dnmt3a-CD）结合DNA具协同性，完整DNMT3A的PWWP域参与染色质靶向，ADD域调控DNA进入催化域。小鼠Dnmt3a与人DNMT3A共享98%氨基酸同一性，催化域高度保守，支持用小鼠Dnmt3a-CD作为模型。此前MGMT启动子中富G链PQS低甲基化而互补C富集链更有效甲基化，c-MYC启动子中G4捕获Dnmt3a-CD并局部阻断甲基化。链身份、定义PQS区域和氧化与hTERT从头甲基化关系仍未知，因此研究人员开展本研究。结论是，Dnmt3a-CD在hTERT核心启动子产生链不对称从头甲基化模式，在定义PQS核心内跨链更均匀且更平滑，光氧化后测量水平降低但大致保留，对C228T/C250T突变大体稳健；Raji DNA中C富集链出现PQS相关低甲基化谷；同时G富集易氧化DNA测序具挑战。其意义在于强调PQS序列背景对hTERT启动子甲基化的重要性，提示单链读取或平均链可掩盖链特异状态，并凸显临床解释hTERT启动子甲基化的测序难点。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法为：以人基因组DNA为模板PCR扩增256-bp hTERT启动子区域，构建pUC19(hTERT)野生型、C228T、C250T、C228T/C250T变体，并制备对应pcrTERT扩增子；样本来源包括Raji细胞系（人Burkitt淋巴瘤B细胞系）基因组DNA和人基因组DNA。使用小鼠Dnmt3a-CD进行体外甲基化，亚甲蓝光氧化，MinION Mk1B/R10.4.1纳米孔测序及modkit碱基修饰调用（0.5阈值），并采用亚硫酸氢盐测序分析Raji DNA。
2.1 底物设计与hTERT核心启动子PQS注释：通过PCR扩增和质粒构建获得四种变体，Dnmt3a-CD甲基化后纳米孔测序，获得306 Mb扩增子数据。27个CpG编号CpG1–CpG27；PQS3位于126–145，PQS2位于147–169，PQS1位于176–192；C250T在147，C228T在169，均位于PQS2；转录起始位点在229。序列映射到5号染色体负链GRCh38 NC_000005.10的chr5:1,295,036–1,295,270。G4Hunter评分和滑动G含量用于注释，但甲基化反应中G4折叠未直接测量。
2.2 基线修饰调用与野生型启动子的从头甲基化：未甲基化WT hTERT扩增子显示标准纳米孔解码模型预测假阳性5hmC（5-hydroxymethylcytosine，5-羟甲基胞嘧啶）和5mC调用。固定0.5修饰质量阈值及modkit自动过滤降低但未消除假阳性；高置信5hmC持续在G/C富集PQS区若干离散位置，最明显在G(?)链；残留假5mC较低。过滤后非氧化WT对照加权假阳性5mC率C(+) 0.18%、G(?) 0.31%，5hmC率0.32%、2.12%。WT甲基化C(+) 36.0%，G(?) 31.4%；所有八个甲基化扩增子样本C(+)加权甲基化高于G(?)。非氧化甲基化扩增子中，加权甲基化平均35.4±3.8%（C）对28.6±3.9%（G），平均链甲基化比C(+)/G(?)为1.24。质粒pUC19(hTERT)保留主谱。结论：Dnmt3a-CD在分析底物中链不对称，偏好C(+)。
2.3 限定PQS核心内链不对称性降低和位点间变异降低：通过逐CpG log
2链比分析，在包含PQS1–3的约98–194 nt GC富集区，链甲基化比接近1；侧翼序列两链不等，比从约5到约0.3。PQS核心内甲基化谱更平滑，每样本每链归一化甲基化SD中位数0.308，而外部0.511，16组中15组如此。按高G4Hunter评分分组而非定义核心几乎无平滑（中位SD 0.513对0.488；16组中8组变异性更低）。甲基化与坐标相关性弱r=?0.075，与G4Hunter评分弱r=0.053。WT 27个CpG中，C链未加权平均在PQS核心内33.7%、侧翼35.3%。C228T、C250T、C228T/C250T仅轻微影响链比，谱保留，成对r=0.94–0.98；四模板模板校正上下文谱高度相似r=0.89–0.97。pUC19(hTERT)质粒保留扩增子模式，位点级5mC r=0.820，链比r=0.872，C>G偏倚更强。结论：定义PQS核心相关链均衡和位点间变异降低，非G4Hunter评分；热点突变单独未显著改变Dnmt3a-CD甲基化谱。
2.4 光氧化DNA经Dnmt3a-CD处理后测得甲基化降低：通过亚甲蓝光氧化后Dnmt3a-CD处理，分离链比较显示光氧化增加平均C/G甲基化比。PQS区约98–194 nt链比近1，侧翼仍不等。氧化与Dnmt3a-CD处理扩增子中测量甲基化较低相关：加权32.0±3.7%降至23.8±7.9%。两链均降低，G(?)更强（氧化平均28.8% C对18.9% G；平均变体特异C/G比1.57；非氧化1.24）。沿扩增子分布广泛保留：匹配氧化与非氧化谱平均Pearson r=0.87，聚合序列上下文谱r=0.948。PQS核心内G链降?12.4对C链?4.9百分点，侧翼G?10.0对C?7.5。光氧化降低测序质量，平均碱基质量从Q25.2降至Q18.0，低质量Q<10比例从16.7%升至34.3%，最低质量集中在坐标64–85和PQS2，均富G。未甲基化对照中，过滤降低假阳性调用但未去除PQS3内坐标135高置信5hmC热点，残留5mC低。结论：光氧化关联链依赖测量甲基化降低，G(?)更明显，PQS核心内更明显，空间谱保留，测序质量下降。
2.5 亚硫酸氢盐测序揭示Raji DNA中PQS相关低甲基化谷：通过Raji DNA Dnmt3a-CD处理与未处理等分亚硫酸氢盐测序。处理样本在CpG16–19（坐标139–172）出现尖锐低甲基化谷，甲基化估计6.08%、4.36%、6.31%、7.12%；肩部CpG14 17.6%、CpG15 25.4%，之后恢复。匹配CpG中，PQS3/PQS2核心（坐标126–169）平均12.0%，侧翼31.2%，相差2.6倍。侧翼最高G4Hunter评分CpG（坐标118–122）仍29–33%甲基化。未处理同一DNA等分也显示中央谷，CpG16–19为11.1%、0%、5.3%、12.5%，零仅CpG17；CpG16–18位于PQS3/PQS2核心，CpG19位于邻接间隙。该共同谷反映Raji DNA内源hTERT启动子甲基化；此比较未检测到可归因于Dnmt3a-CD的额外甲基化。该谷在测试底物中Raji特异：扩增子C(+)链在PQS未抑制（33.7%对35.3%），质粒pUC19(hTERT)也未。结论：Raji DNA中C富集链出现PQS相关低甲基化谷。
讨论部分总结：DNMT3A从头甲基化序列特异性主要归因于靶CpG局部背景，催化效率主要由紧邻核苷酸决定。本分析在局部偏好之外揭示区域模式，与定义PQS区域相关，超出靶CpG及近端侧翼。PQS核心内链不对称和位点间变异更低，而甲基化与G4Hunter评分相关性弱。Dnmt3a-CD在hTERT核心启动子沉积的模式与特定PQS相关，不能仅由预测G4形成潜力捕捉；PQS外侧链不对称，PQS核心内更均匀平滑，光氧化后幅度降低但广泛保留，临床热点突变大体不变；Raji DNA对应区域显示明显低甲基化谷。PQS核心使链比趋近1并降低链内变异，高G4Hunter评分单独无类似平滑。扩增子中PQS内C链甲基化与侧翼相似（33.7%和35.3%），将其与区域低甲基化区分；质粒保留表明不限于短线性底物。纯化Raji gDNA中PQS3/PQS2 C(+)链深度低甲基化，而处理短扩增子和质粒保留该区域甲基化，提示内源甲基化特征。光氧化降低测量甲基化但未广泛重排空间模式，G(?)降低更大；病变可影响有效酶–DNA相互作用。病变定义双链中8-oxoG以位置依赖方式改变Dnmt3a甲基化，当替换CpG内目标胞嘧啶后紧邻鸟嘌呤时抑制尤其强，这提供测量甲基化降低而位置谱保留的可能生化解释。亚甲蓝光敏化产生混合鸟嘌呤病变，因此结果涉及氧化损伤整体。光氧化还降低测序质量，独立实验显示8-oxoG可扰动纳米孔信号和标准basecalling；质量依赖调用效应可能贡献测量降低；未甲基化对照估计假阳性背景但不能校准损伤甲基化DNA中假阴性。细胞中序列偏好与染色质调控共同作用。核小体接触可通过DNMT3B3与酸性patch接触将含DNMT3A2复合物定位至连接DNA，重组核小体强烈保护核心DNA免于甲基化；完整DNMT3A经PWWP依赖H3K36甲基化募集，并借含未甲基化K4的H3解除ADD介导的自抑制。催化域实验分离底物依赖组分，为检查该区域谱在染色质中如何改变提供基础。两个实际意义：模型底物链不对称甲基化表明，读取单链或平均两链的 assay 可掩盖hTERT启动子链特异状态；PQS内两链比侧翼更均匀。C228T/C250T变体中谱大体保留，表明这些替换单独在纯化体外条件下未显著改变Dnmt3a-CD甲基化；其在染色质中效应可能不同，TERT等位基因特异甲基化和表达取决于启动子区域和细胞背景。第二，G富集易氧化序列中假阳性5mC和5hmC调用复杂化该位点单分子研究；修饰概率阈值降低背景，使链和位点特异对照在解释这些谱时有用。
研究结论翻译：Dnmt3a-CD在hTERT核心启动子上产生链不对称的从头甲基化模式，该模式在限定PQS核心内跨链更均匀且更平滑，测量水平降低但在光氧化后大致保留，并且对临床相关C228T/C250T突变大体稳健。相同G富集区域显示背景修饰调用升高，质量阈值部分降低了该背景。在Raji DNA中，对处理和未处理等分试样的亚硫酸氢盐分析在C富集链上鉴定出PQS相关低甲基化谷。在此比较中未检测到可归因于Dnmt3a-CD的额外甲基化。总之，这些结果支持限定PQS与所分析模型底物和Raji DNA中hTERT启动子甲基化模式之间的关联。它们也凸显了测序易氧化、鸟嘌呤富集DNA的困难，无论对于基础研究还是hTERT启动子甲基化的临床解释。
