去泛素化酶（DUBs）在阿尔茨海默病多重病理过程中的作用与靶向治疗潜力：从Aβ和tau到自噬、线粒体、神经炎症及突触功能障碍

《Biomolecules》：Enhancement of Endocannabinoid Signaling by Dual MAGL/ABHD6 Inhibition Reduces Neurodegeneration and Neuro-Inflammation Following AMPA-Mediated Excitotoxicity

　　

阿尔茨海默病（AD）是一种涉及多种病理过程的神经退行性疾病，包括淀粉样β蛋白（Aβ）积累、tau病理、自噬受损、线粒体功能障碍、神经炎症和突触功能障碍。去泛素化酶（DUBs）可逆转泛素化并调节蛋白质稳定性、降解和细胞信号传导。尽管DUBs在AD中的研究主要集中于Aβ代谢和tau稳态，但越来越多的证据表明DUBs参与更广泛的AD相关过程，包括自噬、神经炎症、线粒体功能和突触功能。若干DUBs也被发现参与上述一种以上的过程，尽管这些效应通常是在不同实验模型中被鉴定的。在本综述中，研究人员总结了DUBs在主要AD相关病理过程中的当前知识，并讨论了单个DUBs可能影响AD病理不同方面的机制。研究人员还讨论了当前研究的局限性以及靶向DUBs治疗AD的潜力和挑战。

1. 引言
阿尔茨海默病（AD）是最常见的神经退行性疾病和痴呆主要原因，临床表现为进行性认知下降和记忆障碍。其标志性病理包括由淀粉样β蛋白（Aβ）沉积形成的细胞外淀粉样斑块和由异常磷酸化tau构成的细胞内神经原纤维缠结（NFTs），并伴随神经炎症、线粒体功能障碍、自噬受损和突触损伤。Aβ和tau等异常蛋白的持续积累反映AD脑内蛋白质稳态破坏。泛素-蛋白酶体系统是细胞蛋白质质量控制的重要组成，泛素化由E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶级联介导，调节底物稳定性、定位、活性和相互作用。泛素链可通过M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63等连接类型编码不同信号，其中K48连接多泛素链通常介导蛋白酶体降解，K63连接链主要参与非降解过程。泛素化可逆，其逆转由去泛素化酶（DUBs）介导。越来越多证据表明，DUBs在AD中的作用不限于Aβ代谢和tau稳态，还涉及自噬、线粒体功能、神经炎症和突触功能。本综述总结DUBs在Aβ和tau病理、自噬功能障碍、线粒体功能障碍、神经炎症、突触功能障碍及其他AD相关过程中的作用和分子机制，并讨论跨多个病理过程发挥作用的DUBs、当前证据的背景和局限以及调节DUB活性的治疗机会与挑战。

2. DUBs的分类及其在阿尔茨海默病中的失调
DUBs是通过切割泛素链或从底物蛋白移除泛素来逆转或编辑泛素化的蛋白酶，调节蛋白质稳态、细胞信号、细胞周期进程和DNA损伤反应。人类基因组编码约100种DUBs，根据催化结构域分为七个主要家族。泛素特异性蛋白酶（USP）、泛素C端水解酶（UCH）、卵巢肿瘤蛋白酶（OTU）、Machad–Josephin结构域蛋白酶（MJD）、MINDY和ZUFSP/ZUP1家族为半胱氨酸蛋白酶，催化活性依赖活性位点半胱氨酸。JAMM/MPN+家族为锌依赖金属蛋白酶。结构域结构、底物识别和泛素链选择性的差异导致DUBs功能多样性。AD中泛素稳态被破坏，DUBs也可能失调。UCH-L1因潜在临床相关性受到关注，脑脊液（CSF）UCH-L1水平与疾病进展、MMSE评分和tau病理相关；血浆UCH-L1在AD所致轻度认知障碍个体中升高，并在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）治疗后下降。遗传证据也显示DUBs改变与AD相关：UCH-L1 S18Y多态性Y等位基因和YY基因型在女性中对散发性AD具有保护作用；中国AD和额颞叶痴呆（FTD）患者中约1%存在四种罕见CYLD变异；阿尔茨海默病神经影像学倡议（ADNI）数据发现USP10遗传变异与海马亚区体积和认知表现相关，纯合和杂合USP10变异在齿状回颗粒细胞和分子层（GC-ML-DG）体积上存在差异。AD死后脑组织中USP10、USP11和USP13均升高。这些发现表明DUBs改变发生于遗传变异、蛋白丰度和CSF水平等多个层面。

3. DUBs在AD核心病理机制中的作用
3.1 DUBs调控tau清除与聚集
Tau是微管相关蛋白，在健康神经元中稳定微管并支持神经元形态和轴突运输。AD中tau发生异常翻译后修饰，从微管解离并聚集为NFTs，破坏微管完整性和细胞内运输，导致神经元功能障碍和死亡。DUBs通过直接去泛素化tau以及间接调节tau表达和磷酸化来调控tau降解和聚集。OTUB1直接与tau相互作用并以催化活性依赖方式移除K48连接多泛素链，损害tau降解；在原代神经元中过表达Otub1增加总tau和AT8抗体检测的Ser202/Thr205磷酸化tau，促进tau寡聚化和种子聚集；在TauP301S小鼠脑内过表达Otub1也增加AT8阳性和寡聚tau。USP7直接与tau相互作用并抵消CHIP介导的tau泛素化，增加tau稳定性；过表达增加细胞tau水平，遗传缺失或药理抑制降低tau丰度；在PS19小鼠中敲低USP7减少总tau和磷酸化tau，减轻胶质增生和tau种子活性，改善记忆缺陷；在rTg4510小鼠神经元和海马切片培养中，抑制USP7减少种子tau聚集并增加残余tau包涵体多泛素化。USP10直接去泛素化tau并延迟其降解，增加总tau和磷酸化tau水平并促进tau聚集；USP10在AD死后脑组织和APP/PS1小鼠中上调，但在P301S小鼠中不上调；Aβ₄₂暴露诱导原代神经元USP10表达；遗传缺失或药理抑制USP10减少种子tau聚集而不显著影响可溶性tau；USP10还以不依赖去泛素化活性的方式促进神经元细胞中tau阳性应激颗粒形成，并与AD脑组织磷酸化tau包涵体共定位。USP11是X连锁去泛素化酶，逃避完全X染色体失活，女性脑表达高于男性；USP11蛋白在AD死后脑组织中升高，并与女性tau病理关联强于男性；机制上USP11去泛素化tau并促进其K274和K281乙酰化，促进病理tau积累；Usp11基因缺失优先减少雌性P301S小鼠乙酰化tau积累和tau病理，改善空间记忆。USP13在AD死后脑中约升高两倍；在原代皮层神经元中敲低USP13增加20S蛋白酶体活性并降低磷酸化tau；在TgAPP小鼠中敲低USP13降低淀粉样水平，在rTg4510小鼠中增加磷酸化tau泛素化和清除。USP9X和USP9Y分别位于X和Y染色体；USP9Y在成年男性脑中有明显性别特异性表达，在男性AD多个脑区显著下调；斑马鱼胚胎中usp9敲低显著降低mapta和maptb表达，DU145细胞中联合敲低USP9X/USP9Y降低MAPT表达；但野生型小鼠齿状回局部敲低Usp9x增加而非降低tau磷酸化。USP14是蛋白酶体相关DUB，选择性抑制剂IU1-47加速原代神经元中野生型tau、P301L和P301S突变体以及A152T变体的降解，tau K174对此效应必需；但IU1在大鼠皮层神经元中降低tau水平而不增强蛋白酶体活性并引起神经毒性，Usp14遗传缺失不改变总tau水平而增加小鼠脑内tau磷酸化；wogonoside功能化超小Cu_2?xSe纳米颗粒抑制USP14，减少磷酸化tau积累和突触损伤，改善AD小鼠认知。UCH-L1与AD脑NFT共定位，可溶性UCH-L1水平与NFT负担负相关；药理抑制或敲低UCH-L1降低tau微管结合能力，增加其磷酸化和异常聚集；UCH-L1敲低增加Ser396 tau磷酸化，过表达产生相反效果；在蛋白酶体受损时，抑制UCH-L1减少K63连接泛素化和HDAC6活性，破坏HDAC6与tau相互作用，损害tau聚集体形成。

3.2 DUBs调控Aβ生成与代谢
Aβ由β-位点APP裂解酶1（BACE1）和γ-分泌酶依次切割淀粉样前体蛋白（APP）产生，细胞外Aβ积累形成淀粉样斑块并促进神经炎症、氧化应激和突触功能障碍。目前有限证据表明DUBs直接靶向Aβ肽，DUBs更多通过调节APP和BACE1稳定性和降解间接影响Aβ水平。USP8是内体相关DUB，通过移除BACE1 K501位泛素限制其溶酶体靶向并促使其再循环，稳定BACE1并促进Aβ生成；USP8缺失增加BACE1泛素化和溶酶体降解，减少BACE1介导的APP切割和Aβ生成。USP14药理抑制增强蛋白酶体活性并促进神经毒性tau清除，IU1及其新类似物AA10和AA51减轻细胞和秀丽隐杆线虫AD模型中的Aβ毒性。USP25基因位于21号染色体，基因剂量增加被认为与唐氏综合征（DS）和AD病理相关；在CHO细胞急性内质网应激下USP25水平降低，伴随APP泛素化和蛋白酶体降解增加及Aβ生成减少；在AD小鼠模型中，USP25过表达加重5×FAD小鼠淀粉样沉积，遗传缺失或药理抑制降低脑Aβ水平和淀粉样负担；机制上USP25去泛素化APP和BACE1并限制其溶酶体降解，增加其丰度并促进淀粉样APP加工。UCH-L1在AD死后脑组织中降低，通过调节BACE1和APP周转影响Aβ病理；UCH-L1过表达减少BACE1丰度和淀粉样APP加工，降低C99和Aβ水平；UCH-L1促进BACE1降解，但BACE1是否为直接底物尚不清楚；UCH-L1还增加游离泛素池，促进APP泛素化和溶酶体降解，减少Aβ生成；AD小鼠模型中UCH-L1过表达降低脑Aβ水平和淀粉样斑块负担，改善学习和记忆缺陷。Aβ_1–42暴露通过NF-κB信号抑制UCH-L1活性，导致溶酶体降解受损和BACE1积累，可能进一步增加Aβ生成。

3.3 DUBs调控AD中的自噬
自噬-溶酶体系统是清除错误折叠蛋白、蛋白聚集体和受损细胞器的主要降解途径，自噬流受损导致AD蛋白质稳态破坏。DUBs通过编辑核心自噬蛋白和选择性自噬受体上的泛素链参与自噬多个阶段。例如USP1移除ULK1的K63连接泛素修饰，维持其亚细胞定位并支持经典自噬；OTUB1稳定mTORC1抑制剂DEPTOR，促进自噬；USP13移除p62/SQSTM1 K7位K48和K63连接泛素链，增强p62稳定性和寡聚化，促进p62介导的选择性自噬；相反，USP8优先移除p62 K420位K11连接泛素链，抑制其自噬活性。这些机制主要在非AD模型中表征。USP7通过维持细胞内游离泛素池支持脑内自噬，介导泛素前体UBA52加工，该过程受MLKL促进；MLKL缺失损害UBA52加工，降低游离泛素水平，减少自噬调节因子BECN1和ULK1的K63多泛素化和丰度；USP7缺失同样降低游离泛素水平并损害自噬流；Mlkl缺陷导致自噬障碍和认知功能障碍，加重AD小鼠模型病理。USP9X除影响tau表达和磷酸化外，还通过自噬途径影响tau清除；USP9X在P301S tauopathy小鼠海马中上调，伴随Raptor泛素化减少；USP9X去泛素化并稳定Raptor，激活mTORC1并抑制自噬；WP1130处理增加Raptor泛素化和降解，增强自噬，促进tau和磷酸化tau降解；但野生型小鼠齿状回敲低Usp9x与自噬功能障碍相关。USP11是自噬负调节因子；哺乳动物细胞中USP11敲除通过促进NRBF2与PI3KC3-C1关联并加速mTOR周转增强自噬流；秀丽隐杆线虫中USP11同源物H34C03.2缺失激活自噬，减轻Aβ₄₂聚集诱导的瘫痪。USP14除通过蛋白酶体活性调节tau周转外，还参与自噬调节；IU1-47增强原代神经元自噬流；但另一项研究显示USP14抑制激活蛋白酶体，加速UVRAG降解，损害自噬体-溶酶体融合并减少自噬流，提示USP14抑制对自噬的影响依赖实验背景。

3.4 DUBs调控神经炎症
神经炎症是AD发病的重要组成，主要由微胶质细胞介导。微胶质细胞通过清除Aβ和细胞碎片维持组织稳态，持续失调则促进炎症反应、突触功能障碍和神经元损伤。USP25过表达加重微胶质激活、神经炎症、突触丢失和认知障碍，遗传减少USP25减轻5×FAD小鼠这些异常；机制上USP25缺失抑制促炎细胞因子产生和微胶质对突触的过度吞噬，部分恢复稳态微胶质特征。OTUD1在AD小鼠模型和Aβ刺激BV2微胶质细胞中上调，遗传缺失减轻神经炎症和认知障碍；OTUD1移除C/EBPβ Lys253位K48连接多泛素链，稳定C/EBPβ并增强其介导的NF-κB信号。OTUD6A也在多个AD小鼠模型微胶质中上调，缺失减轻神经炎症和认知缺陷；与OTUD1类似，OTUD6A移除C/EBPβ Lys253位K48连接泛素链，稳定C/EBPβ，增强NF-κB信号和促炎细胞因子产生。YOD1在Aβ刺激微胶质和AD小鼠模型中上调，微胶质缺失YOD1恢复迁移和吞噬，减轻炎症反应，改善AD小鼠认知缺陷；机制上YOD1移除MYH9 K48连接泛素链并维持其稳定性，调节微胶质稳态。USP53在AD死后脑组织中升高，5×FAD小鼠中遗传缺失Usp53减轻微胶质和星形胶质反应性，减少促炎细胞因子产生和tau积累，改善学习和记忆；机制上USP53与NOTCH2相互作用并去泛素化NOTCH2，稳定NOTCH2并增强微胶质中IKKβ/NF-κB信号。

3.5 DUBs调控线粒体功能障碍
线粒体功能障碍是AD重要病理特征，神经元依赖线粒体维持能量产生、钙稳态和突触功能。AD中广泛观察到氧化磷酸化受损、活性氧（ROS）过度产生、线粒体动力学改变和线粒体自噬缺陷。主要来自帕金森病相关或其他非AD模型的研究表明，DUBs通过修饰Parkin或其线粒体底物调节线粒体质量控制。USP8移除Parkin K6连接泛素链，促进其募集到去极化线粒体，支持Parkin依赖线粒体自噬；但USP8下调也增强Parkin非依赖基础线粒体自噬。USP14遗传或药理抑制通过DRP1依赖和MFN2依赖机制促进线粒体自噬，独立于经典PINK1/Parkin通路。USP15和USP35抑制Parkin介导线粒体自噬而不显著影响Parkin募集。USP33直接去泛素化Parkin，其缺失增强Parkin泛素化和线粒体募集，促进线粒体自噬。在AD相关模型中，USP19敲低在Aβ_1–40处理的SH-SY5Y细胞中恢复MFN1和MFN2表达，降低DRP1水平，减轻铁积累、氧化应激和铁死亡相关细胞损伤；机制上USP19与NOX4相互作用并通过限制其泛素化稳定NOX4。USP30是外线粒体膜定位DUB，通过移除线粒体表面蛋白泛素链负调节PINK1/Parkin依赖线粒体自噬；抑制USP30增强线粒体泛素化，促进受损线粒体清除；CMPD-39增强线粒体自噬，MTX325在帕金森病小鼠模型中显示神经保护作用。在AD相关模型中，miR-137-5p靶向USP30，减轻Aβ_1–42诱导的SH-SY5Y细胞神经毒性，小鼠给药改善认知功能，减少Aβ沉积、tau过度磷酸化和神经元凋亡。UCH-L1也可能参与tau相关线粒体质量控制失调；原代神经元中N端截短tau（NH₂htau）诱导过度Parkin依赖线粒体自噬，伴随UCH-L1异常募集至线粒体；敲低UCH-L1或Parkin抑制过度线粒体清除，恢复线粒体和突触含量，部分保护神经元免于NH₂htau诱导死亡；AD患者突触线粒体中内源性NH₂htau与Parkin和UCH-L1稳定关联。

3.6 DUBs调控其他AD相关病理过程
除上述过程外，DUBs还参与突触功能障碍和神经祖细胞功能受损。USP46调节AMPA受体（AMPARs）泛素化和周转；原代神经元中Aβ暴露降低USP46表达而增加E3连接酶NEDD4，伴随AMPAR泛素化和降解增强，AD患者脑组织中也观察到类似改变。UCH-L1通过维持神经元泛素稳态和PKA–CREB信号支持突触可塑性；恢复UCH-L1活性减轻Aβ诱导的长时程增强缺陷，改善APP/PS1小鼠情境记忆。USP16可能通过限制神经祖细胞自我更新损害神经再生；在Tg-SwDI小鼠和APP突变人细胞模型中，USP16缺失恢复祖细胞功能，改善认知缺陷，可能通过调节H2AK¹¹⁹单泛素化和CDKN2A/BMP信号。

4. 参与多个AD相关病理过程的DUBs
现有证据表明，单个DUB可通过作用于不同底物和信号通路影响AD多个病理过程。USP25通过稳定APP和BACE1促进Aβ生成，同时加重微胶质介导的神经炎症。USP7稳定tau并促进其病理积累，同时维持细胞内泛素稳态和自噬功能，其不同活性可能产生不同甚至相反的病理后果。USP9X表现出复杂且依赖背景的效应：除潜在调节tau表达和磷酸化外，P301S小鼠中USP9X升高稳定Raptor并激活mTORC1，抑制自噬性tau清除；而野生型小鼠齿状回敲低Usp9x导致自噬功能障碍。这些例子提示不同AD相关病理过程之间可能存在联系。DUB总体效应不能从单一底物或下游表型推断，而取决于其底物谱和特定细胞与病理背景，包括细胞类型、脑区和疾病阶段。靶向某些DUB的干预可改善多个AD相关病理表型，例如靶向USP11的化合物IsoLiPro减少3×Tg-AD和5×FAD小鼠tau和淀粉样病理，减轻突触损伤并改善认知功能；Usp53遗传缺失减轻5×FAD小鼠神经炎症和tau积累，改善学习和记忆。然而，广泛表型改善不一定证明这些DUB直接调控多个病理通路，剩余病理改变可能代表直接效应、继发下游后果或实验干预脱靶效应。当前证据尚不足以证明这些DUB直接协调不同病理过程间的相互作用。未来需结合细胞类型特异性操作、跨疾病阶段纵向分析以及整合蛋白质组和泛素组分析。

5. DUBs在AD中的药理学靶向
DUBs具有明确催化活性和结构可及催化口袋，是泛素系统中药理学干预的吸引靶点。靶向单个DUB可能比广泛干扰蛋白降解更具选择性。USP25抑制剂AZ1减少5×FAD小鼠脑切片淀粉样斑块负担。USP14抑制剂IU1及其更有效衍生物IU1-47增强蛋白酶体降解；IU1-47降低3×FAD原代皮层神经元和人iPSC来源神经元中总tau和磷酸化tau水平。靶向USP11的IsoLiPro增加tau泛素化并促进tau清除，长期口服减少AD转基因小鼠总tau和磷酸化tau水平，减轻淀粉样沉积和突触损伤，改善认知表现。wogonoside功能化超小Cu_2?xSe纳米颗粒（CSPW NPs）抑制USP14，增强泛素-蛋白酶体介导的高磷酸化tau清除；通过细胞膜包被和聚焦超声辅助，这些纳米颗粒更有效跨越血脑屏障并靶向神经元，在AD小鼠中减少tau病理和突触丢失，改善微管稳定性和突触完整性，减轻认知缺陷。然而，大多数证据仍限于细胞和动物模型，临床转化尚处早期。DUB靶向治疗面临重要挑战：实现足够选择性是主要难题，多数DUB为半胱氨酸蛋白酶，同家族成员常共享保守催化特征，针对催化位点的化合物可能抑制相关DUB或其他半胱氨酸依赖酶；结构导向药物设计和保守催化中心外别构位点识别可能提高靶点选择性。药物可及性对AD尤为重要，需仔细评估血脑屏障通透性、脑暴露和药代动力学。DUB广泛生物学功能增加复杂性，单个DUB常作用于多个底物，可能参与不同甚至相反细胞过程。治疗性调节DUB不应仅限于抑制，一些DUB在AD中似乎具有保护功能，例如UCH-L1功能丧失与tau磷酸化增加、蛋白质稳态受损和突触功能障碍相关，此类情况下恢复DUB表达或增强其活性可能比抑制更合适。未来治疗策略应根据每个DUB在AD中的具体作用选择抑制、激活或功能恢复，并提高底物选择性以限制对生理功能的干扰。

6. 结论
AD是涉及多种病理过程的神经退行性疾病，研究传统上聚焦于Aβ和tau等异常蛋白积累，但自噬受损、线粒体功能障碍、神经炎症和突触损伤日益被认为是AD发病的重要组成，其中部分改变出现在疾病早期。DUBs是细胞蛋白质稳态的重要调节因子，越来越多证据将其失调与Aβ和tau代谢、自噬、线粒体功能、神经炎症和突触功能联系起来。本综述总结了DUBs在这些AD相关病理过程中的作用。尽管近期取得进展，对DUBs在AD中的理解仍存在重大空白：仅有限DUB在AD相关模型中得到研究，许多涉及毒性蛋白清除和线粒体质量控制的机制主要在帕金森病或其他神经退行性疾病中表征。识别更多AD相关DUB并建立其因果相关性将十分重要。对于影响多个病理过程的DUB，确定其直接底物和下游通路对区分直接效应与继发改变尤为关键。还需要来自人脑组织、患者来源细胞和脑类器官的进一步证据，因为DUB丰度变化本身可能不反映催化活性或底物调节变化。最后，尽管药理调节若干DUB在实验模型中显示有益效果，治疗研究仍大多处于临床前阶段。需进一步确定合适靶点以及个体DUB应被抑制还是恢复，同时解决药物选择性、脑暴露和长期安全性问题。