《Toxins》：Validation of a HILIC–LC–MS/MS Method for Simultaneous Determination of Paralytic Shellfish Toxins and Tetrodotoxins in Multiple Marine Matrices: The Critical Role of Matrix Effects
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海洋生物毒素（marine biotoxins）在海洋生物体内的存在与蓄积，包括麻痹性贝类毒素（paralytic shellfish toxins, PSTs）和河鲀毒素（tetrodotoxin, TTX）类似物，构成了重大的食品安全隐患。本研究描述了一种
海洋生物毒素（marine biotoxins）在海洋生物体内的存在与蓄积，包括麻痹性贝类毒素（paralytic shellfish toxins, PSTs）和河鲀毒素（tetrodotoxin, TTX）类似物，构成了重大的食品安全隐患。本研究描述了一种定量确证型亲水相互作用液相色谱–串联质谱（HILIC–LC–MS/MS）方法的验证，用于在四种基质中同步测定多种海洋毒素：贻贝、蛤蜊、海螺和海胆。该方法覆盖17种目标化合物，包括TTX类似物（TTX、4-epiTTX和4.9-anhTTX）、石房蛤毒素及其类似物（STX、dcSTX、NEO和dcNEO）、膝沟藻毒素（GTX 1–4、GTX 2–3、GTX 5、GTX 6和dcGTX 2–3）以及磺酰氨甲酰基毒素C1–C2。研究特别关注了基质效应（matrix effects, ME）的评估，这是影响LC–MS/MS定量分析的关键因素。该方法依据SANTE/11312/2021指南进行验证，显示出令人满意的选择性、精密度（RSD ≤ 20%）和准确度（回收率在70–120%范围内）。在所调查的物种中观察到显著的基质依赖性信号抑制和增强。基质匹配校准可实现贻贝、蛤蜊和海螺中的可靠定量，而海胆样品则表现出更大的分析复杂性。该验证方法为在不同海洋生物中测定PSTs和TTX类似物提供了稳健的技术手段，并支持其在官方监测计划中的应用。
论文解读：HILIC–LC–MS/MS同步测定多种海洋基质中麻痹性贝类毒素与河鲀毒素的方法验证及基质效应关键作用
一、研究背景与问题
有害藻华（harmful algal blooms, HABs）日益成为重大环境与公共卫生问题，其由产毒微藻在水生生态系统中大量增殖引起，受营养盐富集、海岸开发、物种引入和化学污染等多种人为及自然因素驱动。近几十年来，气候变化通过改变海洋温度、pH值和分层模式进一步加剧了有害藻华的发生，从而影响浮游植物动态和毒素产生，导致海产品中海洋生物毒素蓄积增加，对人类健康和海洋生态系统构成持续风险。
在海洋生物毒素中，麻痹性贝类毒素（paralytic shellfish toxins, PSTs）因其强效神经毒性和广泛分布而属于最具危害性的类群之一，是麻痹性贝类中毒（paralytic shellfish poisoning, PSP）的致病因子。PSTs主要由亚历山大藻（Alexandrium）、膝沟藻（Gymnodinium）和梨甲藻（Pyrodinium）等海洋甲藻以及多种淡水蓝藻产生。在有害藻华期间，PSTs可在贻贝、牡蛎、扇贝和蛤蜊等滤食性双壳软体动物体内蓄积，且不改变海产品的感官特性，使消费者无法察觉污染。化学上，PSTs包含超过50种类似物，共享共同的四氢嘌呤骨架，按侧链取代基差异分为氨基甲酸酯类、脱氨甲酰基类和N-磺酰氨甲酰基类，毒性差异显著。PSTs通过阻断神经细胞电压门控钠通道发挥毒性作用，低剂量即可导致神经症状，严重时可致肌肉麻痹、呼吸窘迫甚至死亡，且常规食品加工手段无法消除。
除PSTs外，河鲀毒素（tetrodotoxin, TTX）作为日益受关注的海产神经毒素，与PSTs作用机制相似。至少已鉴定出25种TTX类似物，其确切来源仍有争议，但越来越多证据指向微生物来源。TTX近期在地中海和北大西洋等欧洲水域的双壳软体动物中频繁检出，例如西西里岛2015–2017年的一项研究首次记录了TTX（0.8–6.4 μg/kg）与PST（10,851 μg STX 2HCl eq/kg）的共存现象。
监管方面，欧盟对活双壳软体动物中PSTs设定的最高允许水平为800 μg STX equivalents kg?1，欧洲食品安全局（EFSA）确定了1.5 μg STX equivalents/kg体重的最低观察到不良效应水平（LOAEL）。然而TTX尚无统一监管限值，仅提出了0.25 μg kg?1体重的急性参考剂量（ARfD）。自2017年起，欧盟委员会规定使用柱前衍生化液相色谱–荧光检测（LC-FLD）等化学方法替代小鼠生物试验（MBA）进行PSTs鉴定与定量。
PSTs和TTXs的测定因其高极性、结构多样性和类似物间毒性差异而面临挑战。海洋基质的复杂性可引起显著基质效应，影响分析准确度和重现性。PSTs与TTXs的共存构成重大新兴风险，推动了对具有更高灵敏度和选择性的同步分析方法的需求。研究人员所在实验室2021–2025年官方PST监测计划分析了约1800份样品，包括贻贝（61%）、蛤蜊（37%）和其他物种（约2%），使用官方HPLC-FLD参考方法均未检出高于检出限（LOD）的PSTs，证实了当地海产品生产的高安全标准。在此背景下，本研究旨在通过开发和验证一种定量确证型HILIC-LC-MS/MS方法，提高分析灵敏度并克服现行官方方法的局限性，实现对代表性海洋基质中PST和TTX的同步测定。
二、主要关键技术方法
研究人员开发并验证了一种基于亲水相互作用液相色谱–串联质谱（HILIC–LC–MS/MS）的定量确证方法，使用AB Sciex 6500+三重四极杆质谱仪耦合Agilent 1290高效液相色谱系统，采用Waters XBridge BEH Amide色谱柱（2.1 × 100 mm, 2.5 μm）在45 °C下进行梯度洗脱分离，正负电喷雾离子化模式同时检测。样品制备采用1 g匀浆样品经含1%甲酸的35%乙腈提取液提取，90 °C水浴加热5分钟，离心后经C18固相萃取（SPE）净化。方法依据SANTE/11312/2021指南验证，评估了选择性、线性、回收率、精密度、基质效应和定量限（LOQ）。基质效应通过比较纯溶剂标准曲线与基质匹配校准曲线斜率进行评估，并采用提取前后加标方式计算基质效应%（ME%）、提取回收率%（RE%）和过程效率%（PE%）。验证使用了WEPAL-Quasimeme提供的两种参考物质BT12-20和BT12-27。
三、研究结果
2.1 HPLC-MS/MS条件优化： 研究人员基于Turner等2020年的方法，对流动相组成、流速和色谱梯度进行了修改，优化了多反应监测（MRM）转换和碰撞能量（CE）等仪器参数，以实现对所有目标毒素的最大选择性。
2.2 方法验证：
2.2.1 选择性： 在所有分析样品中，目标分析物保留时间处均未观察到干扰信号，确认了方法具有足够的选择性。
2.2.2 基质效应： 通过比较纯溶剂标准曲线与提取后基质匹配校准曲线的斜率评估基质效应，结果显示不同贝类基质间基质效应存在显著差异：贻贝中为13–162%，蛤蜊中为44–210%，海螺中为27–146%，海胆中为6–370%。STX、dcSTX、NEO和dcNEO在海胆中普遍表现出显著的离子抑制，而4.9-anhTTX和4-epiTTX在蛤蜊和海胆中表现出显著的信号增强。基质效应的幅度强烈依赖于基质和分析物，凸显了基质匹配校准的必要性。通过比较纯溶剂标准溶液与提取前后加标样品的平均峰面积进一步确认了基质效应的分析物和基质依赖性。提取回收率（RE）同样呈现异质性模式，部分RE值超过150–200%表明表观回收率被残余离子增强所夸大，而极低回收率则提示提取过程中的显著损失或分析物潜在不稳定性。
2.2.3 线性与定量限： 基质匹配校准曲线的决定系数（R2）≥0.995且残差随机分布。定量限（LOQ）经实验验证，符合现行欧洲监管要求（SANTE/11312/2021）。主要基质（贻贝和蛤蜊）的PST校准曲线基于六个浓度水平（273–3187 μg STX 2 HCl eq/Kg），次要基质（腹足类和棘皮类）基于四个水平（546–1183 μg STX 2 HCl eq/Kg），LOQ基于信噪比≥10的标准估算。
2.2.4 准确度与精密度： 准确度和精密度符合SANTE指南的接受标准，平均回收率在70–120%范围内，精密度（RSD）≤20%。使用两种WEPAL-Quasimeme参考物质验证了方法的准确度。
四、讨论与结论
讨论部分指出，近十年来HILIC-MS/MS被广泛研究用于PSTs和TTXs的同步测定，因其能高效分离高极性毒素和异构体，同时提供灵敏和选择性检测。然而基质效应仍是主要挑战，共提取化合物和盐类可影响电离效率，导致信号抑制或增强。文献报道的基质效应差异显著，从55–94%的离子抑制到可忽略的0.90–1.03斜率比不等，取决于分析物化学特性、基质组成和样品制备程序。本研究首次在棘皮动物中采用广泛的PST和TTX毒素组合研究基质效应。结果表明，海胆是最具挑战性的基质，始终表现出最显著的ME%和RE%值，这可能与其复杂组成和共提取干扰成分有关，在HILIC条件下高极性内源性化合物可能与目标毒素共洗脱并影响电离效率。相比之下，基质匹配校准足以补偿其他研究基质中的基质效应，提示海胆可能需要额外的净化步骤以进一步减少基质干扰。
研究结论为：本研究开发并验证了一种快速、稳健、可靠的HILIC–LC–MS/MS方法，用于在多种海洋基质（包括双壳软体动物贻贝和蛤蜊、腹足类海螺和棘皮类海胆）中同步测定17种PSTs和TTX类似物。该方法克服了基于柱前衍生化的LC-FLD方法的若干局限性，为高极性海洋生物毒素分析提供了改进的选择性和简化的工作流程。全面的基质效应评估表明离子抑制和增强存在显著且不可预测的变化，取决于毒素类似物和生物基质，确认溶剂校准不足以实现可靠定量，强调了基质匹配校准曲线的重要性。针对贻贝和蛤蜊优化了较低的定量限，能够检测和准确评估低浓度毒素和新兴毒素特征。该验证方法为不同海洋生物中受监管PST和新兴TTX类似物的同步监测提供了可靠的分析平台，支持官方控制活动并有助于改善食品安全风险评估。未来将进一步完善棘皮动物分析的净化步骤，并扩展到鱼类、甲壳类和头足类等新海洋基质。
