靶向Mucorales胞外多糖的泛Mucorales单克隆抗体FH12夹心ELISA用于人毛霉病检测

《Journal of Fungi》：Development of a Monoclonal Antibody and a Sandwich ELISA for the Detection of Mucormycosis in Humans

背景：毛霉病（mucormycosis）是一种由Mucorales目霉菌引起的快速进展且常致死的侵袭性真菌感染。早期诊断对有效临床管理至关重要；然而，培养和组织病理学等传统诊断方法缓慢、不敏感，并需要专业的真菌学知识。尽管已有分子方法可用于疾病检测，但其可及性不广。目前，尚无用于检测毛霉病的酶免疫分析（EIA）。方法：研究人员制备了一种鼠源IgG₁单克隆抗体（mAb）FH12，其针对Mucorales病原体在活跃生长过程中产生的胞外多糖（EPSs）。使用酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹（immunoblotting）和免疫荧光（immunofluorescence）技术对抗体的特异性、表位稳定性和抗原定位进行了表征。该mAb被整合到夹心ELISA中，并使用培养滤液、加标到人血清中的纯化EPSs，以及来自一例由Lichtheimia ramosa引起的皮肤毛霉病患者的组织匀浆进行评价。结果：mAb FH12显示出泛Mucorales特异性，且与其他临床相关酵母和霉菌无交叉反应。FH12识别的表位对过碘酸盐不敏感，并具有中等热稳定性。夹心ELISA可检测人血清中的EPS抗原，检测限范围为pg/mL至低ng/mL水平，并成功识别患者组织匀浆中的EPS生物标志物。结论：基于FH12的夹心ELISA显示出高灵敏度和特异性，有潜力用作检测人毛霉病的实验室辅助诊断试验。

论文解读：

毛霉病（mucormycosis）是由Mucorales（毛霉目）真菌引起的一种快速进展、血管侵袭性、常可致死的人类感染，可表现为鼻-眶-脑毛霉病（rhino–orbital–cerebral mucormycosis, ROCM）、肺毛霉病、皮肤毛霉病、胃肠道毛霉病和播散性感染。常见人类病原包括Apophysomyces variabilis、Cunninghamella bertholletiae、Lichtheimia corymbifera、Lichtheimia ramosa、Mucor circinelloides、Rhizomucor pusillus、Rhizopus arrhizus和Rhizopus microsporus。Mucorales感染被世界卫生组织认定为全球高优先级病原群，在东南亚被其他机构认定为关键优先级病原群，死亡率可高达80%。及时检测并与其他霉菌病原如Aspergillus fumigatus区分对患者生存至关重要，可及时进行手术和抗Mucorales药物治疗。传统诊断依赖活检样本的组织病理学和真菌培养，以及显微镜下特征性形态结构识别，但这些方法费时、不敏感且需要真菌学专业知识。分子方法如宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing, NGS）和基质辅助激光解吸电离飞行时间（matrix-assisted laser desorption ionisation time of flight, MALDI-TOF）可用于培养后鉴定，但可及性有限。聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）已用于检测人血清和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALf）中的循环Mucorales核酸，但目前尚无用于毛霉病检测的酶免疫分析（enzyme immunoassay, EIA）作为辅助试验。因此，研究人员开展本研究，旨在开发针对Mucorales活跃生长期间产生的胞外多糖（extracellular polysaccharides, EPSs）的单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）和夹心ELISA，以实现实验室检测人生物体液中的EPS抗原。此前已报道种特异性、属特异性和泛Mucorales特异性mAbs检测Mucorales EPSs，并用于侧流免疫分析；本研究报道mAb FH12及基于其的夹心ELISA，并证明其可在人血清中检测EPSs，且可从皮肤毛霉病患者组织匀浆中检出生物标志物。原文指出，这是首次报道泛Mucorales特异性夹心ELISA用于毛霉病检测，具有作为实验室辅助诊断试验的潜力。

主要关键技术方法：研究人员采用杂交瘤技术制备mAb，以Apophysomyces variabilis CBS658.93的EPS为免疫原免疫BALB/c小鼠，融合后经间接ELISA筛选；对纯化mAb进行同种型鉴定、蛋白A纯化及辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）标记。采用直接ELISA、夹心ELISA、菌落免疫印迹、Western blotting和免疫荧光进行特异性、表位稳定性、抗原定位及抗原时空产生分析。用Mucorales和非Mucorales临床相关真菌培养滤液评价特异性；用加标纯化EPSs的运行缓冲液和人血清确定检测限，并优化血清热处理流程。临床样本来源为Hudson et al.报道的一例免疫功能正常男性患者，因右手皮肤及软组织毛霉病由Lichtheimia ramosa strain 266533346引起，检测其组织匀浆；未使用大队列。

研究结果：

3.1 杂交瘤制备与mAb同种型鉴定：单次杂交瘤融合后，327个杂交瘤细胞系经间接ELISA检测免疫原识别，7个细胞系产生EPS反应性抗体，其中5个产生IgG₁类mAbs，另2个产生IgG_2b类mAbs。细胞系FH12为IgG₁，因其对Mucorales物种广谱特异性且不与non-Mucorales真菌交叉反应而被选进一步评价。

3.2 mAb FH12特异性与表位表征：直接ELISA检测来自最常见人类Mucorales和非Mucorales霉菌病原的纯化EPSs，mAb FH12显示泛Mucorales特异性，与所有测试Mucorales真菌反应，与临床重要无关霉菌病原（Aspergillus、Fusarium、Lomentospora和Scedosporium species）无交叉反应。FH12识别表位对过碘酸盐不敏感，24 h过碘酸盐处理未导致结合损失。100 °C加热60 min期间，mAb结合逐渐下降，但与对照相比仅在超过最初10 min后差异显著（p < 0.05），提示中等热稳定性。

3.3 菌落免疫印迹与免疫荧光：菌落免疫印迹显示FH12抗原为胞外产生，并与真菌菌落生长边缘相关，染色模式与泛Mucorales特异性IgG₁对照mAb TG11相似。对Mucor circinelloides f. circinelloides CBS120582萌发细胞的免疫荧光显示，FH12抗原定位于菌丝和萌发孢子的外细胞壁，但未见于未萌发分生孢子的外细胞壁。

3.4 培养滤液的夹心ELISA与Western blotting：使用在YNB+G液体培养基中生长72 h的酵母和霉菌培养滤液，夹心ELISA显示泛Mucorales特异性，仅与Mucorales真菌滤液强反应，吸光度>0.100，而不与Aspergillus spp.、Candida albicans、Cryptococcus neoformans、Fusarium spp.、Lomentospora prolificans和Scedosporium spp.等无关酵母和霉菌滤液交叉反应，吸光度<0.100。对引起人胃肠道毛霉病的Mucorales病原Rhizomucor pusillus CBS120587的研究显示，病原体生长（菌丝生物量干重）在72 h至96 h间进入平台期，而无关霉菌病原Aspergillus fumigatus Af2923生长持续增加至168 h。夹心ELISA显示FH12 EPS抗原分泌到培养液中，接种后24 h首次可检测，随后升高，并在72 h至96 h间平台。Western blot显示mAb FH12与分子量约25 kDa至约250 kDa的免疫反应性EPS抗原强反应，这些抗原在接种后48 h首次可检测，且不与Aspergillus fumigatus Af293 72 h和96 h培养滤液交叉反应。

3.5 人血清夹心ELISA及检测限：在运行缓冲液中加标纯化Mucorales EPSs，夹心ELISA对Apophysomyces variabilis、Cunninghamella bertholletiae、Lichtheimia corymbifera、Mucor circinelloides和Rhizomucor pusillus的检测限达pg EPS/mL，对Rhizopus arrhizus和Rhizopus microsporus达ng EPS/mL。该夹心ELISA与人血清兼容，在血清中对A. variabilis、C. bertholletiae、M. circinelloides和R. pusillus的检测限为pg/mL，对Lichtheimia corymbifera、Rhizopus arrhizus和Rhizopus microsporus为ng/mL。

3.6 皮肤毛霉病检测：夹心ELISA可检测由Mucorales病原Lichtheimia ramosa strain 266533346引起的皮肤及软组织毛霉病患者组织匀浆中的可溶性FH12 EPS抗原。样本来自患者入院第5天和第14天手术清创时；第5天组织匀浆平均吸光度为1.806 ± 0.076，第14天为0.157 ± 0.006，均显著高于无菌dH₂O对照的平均吸光度0.065 ± 0.004，表明匀浆中存在Mucorales特异性FH12抗原。

讨论部分总结：讨论指出，尽管已有使用Rhizopus arrhizus异质性抗原制剂进行毛霉病血清学检测的间接ELISA，但本研究是首次报道基于mAb的夹心ELISA用于人毛霉病诊断。菌落免疫印迹和萌发孢子免疫荧光显示FH12结合EPSs由Mucorales在活跃菌丝生长期间排泄，Western blot显示其分子量约25 kDa至约250 kDa，与mAb TG11结合的Mucorales细胞壁EPSs相似。但与TG11不同，FH12结合重复表位，因而可用于夹心形式；TG11仅结合单一表位，限制其用于竞争形式侧流免疫分析。FH12表位对酸性pH下温和过碘酸盐氧化不敏感，研究人员认为其结合Mucorales EPSs中的核心碳水化合物表位而非末端糖部分。夹心ELISA是最敏感的ELISA形式之一，也是商用侵袭性肺曲霉病ELISA检测的基础；本研究的泛Mucorales夹心ELISA同样与人血清兼容。FH12表位中等热稳定性使血清可用EDTA热处理以防止免疫分析前带效应，从而在加标人血清中检测Mucorales EPS抗原，灵敏度达pg/mL至低ng/mL，与曲霉病检测EIA相似。FH12特异性可区分致病Mucorales与其他临床重要霉菌和酵母（Candida albicans和Cryptococcus neoformans），这在与Aspergillus species混合感染及其他多种霉菌共感染的鉴别中尤其重要。虽然FH12夹心ELISA尚未用临床血清和BALf标本评价，但研究人员用一例因农业损伤后由Lichtheimia ramosa引起的皮肤及软组织毛霉病患者证明其潜在临床效用。可溶性EPS生物标志物在感染早期清创（第5天）伤口匀浆液中易于检测，在第14天仍可检测但较第5天显著降低，原文将第14天降低与两性霉素B治疗及活动性Mucorales感染停止相联系。FH12夹心ELISA结果与TG11-LFD测试一致，证实Mucorales EPSs作为人毛霉病特征分子的效用；重要的是，夹心ELISA可在传统微生物学测试（培养和组织活检组织病理学）确认皮肤感染前数天检测EPS生物标志物。

结论翻译：总之，研究人员开发了一种灵敏且特异的夹心ELISA用于检测毛霉病，其有潜力作为Mucorales感染的实验室辅助检测。由ISCA Diagnostics Limited（Exeter, UK）开发的用于毛霉病诊断的商业EIA试剂盒目前正在开发中，并将使用来自大量确诊和临床可能毛霉病以及其他侵袭性霉菌感染患者的血清样本进行临床性能评估。