《Biology》：Comparative DIA Proteomics of Neuroblastoma: Laser-Microdissected FFPE Tumors Versus Cell Lines
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福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤标本广泛可得，是回顾性癌症研究的宝贵资源；然而，化学交联在历史上限制了其在蛋白质组学研究中的应用。在本研究中，研究人员开发了一套针对激光显微切割FFPE神经母细胞瘤组织的蛋白质组学工作流程，并将其生物学特征与已建立的神经母细
福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤标本广泛可得，是回顾性癌症研究的宝贵资源；然而，化学交联在历史上限制了其在蛋白质组学研究中的应用。在本研究中，研究人员开发了一套针对激光显微切割FFPE神经母细胞瘤组织的蛋白质组学工作流程，并将其生物学特征与已建立的神经母细胞瘤细胞系进行了比较评估。通过激光显微切割从FFPE切片中分离肿瘤区域，并采用数据非依赖性采集质谱（DIA-MS）分析蛋白质谱。共检测了7例高危神经母细胞瘤FFPE样本和4株神经母细胞瘤细胞系。在FFPE组织中鉴定出4511种蛋白质，在细胞系中鉴定出6812种蛋白质，其中4311种蛋白质为两种体系共有。经质量过滤后，保留2186种蛋白质用于下游定量分析。主成分分析（PCA）和层次聚类显示，尽管在定量蛋白质组的平均蛋白质丰度上存在较强的总体相关性，但FFPE组织与细胞系之间仍呈现清晰分离。差异丰度和功能富集分析揭示了两体系间截然不同的蛋白质组学特征。FFPE组织中富集的蛋白质与细胞外囊泡、细胞外空间、角质化包膜、中间丝组织和细胞连接相关。相比之下，神经母细胞瘤细胞系中富集的蛋白质与RNA结合、翻译、rRNA加工、氧化磷酸化和糖酵解/糖异生相关，反映了增强的生物合成和代谢活性。综上所述，这些发现表明FFPE组织和神经母细胞瘤细胞系捕获了神经母细胞瘤生物学中互补的方面，支持将其联合用作儿科肿瘤学生物标志物发现和转化研究的综合框架。
一、研究背景与意义
神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是一种罕见的儿童实体肿瘤，具有显著的生物学异质性和高危病例预后差的特点。尽管已有大量的基因组学分析，但发现的复发性遗传改变和临床可操作的靶点仍然有限，因此蛋白质组学分析作为补充手段日益受到重视。福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed, paraffin-embedded，FFPE）组织是临床常规保存的标本，具有长期稳定性和详细的临床病理信息关联，为大规模回顾性研究提供了独特资源。然而，甲醛交联在历史上限制了FFPE样本在蛋白质组学中的应用。近年来，激光显微切割（laser microdissection，LMD）、优化的SDS蛋白提取和纳流液相色谱-质谱联用（nano-LC/MS）等技术的进步已基本克服了这些技术限制。
另一方面，神经母细胞瘤细胞系虽被广泛用作实验模型，但不能完全重现患者肿瘤的结构和微环境复杂性。目前尚不清楚FFPE来源的蛋白质组学谱与常规细胞系模型之间的一致性和互补性。阐明这两种常用模型系统之间的异同，对于在临床相关背景下解读回顾性蛋白质组学发现至关重要。此外，高危神经母细胞瘤常表现出显著的瘤内异质性，常规组织整体分析往往掩盖肿瘤内在信号。LMD结合病理医师指导的形态学定义肿瘤区域显微切割，可提高蛋白质组学表征的纯度和精度。
二、研究内容与结论
研究人员对7例2018至2023年间在日本神户儿童医院确诊的高危神经母细胞瘤FFPE样本（5例女性，2例男性，中位年龄4岁）和4株神经母细胞瘤细胞系（CHP-134、NB-69、NH-12、SK-N-AS）进行了比较性DIA蛋白质组学分析。FFPE样本的MYCN扩增状态通过荧光原位杂交（FISH）确定，细胞系则根据RT-qPCR检测的相对MYCN mRNA表达水平分为MYCN高表达（CHP-134、NH-12）和低表达（SK-N-AS、NB-69）。
研究结果显示，FFPE组织中共鉴定出4511种蛋白质，细胞系中鉴定出6812种，其中4311种为共有。FFPE组织独有蛋白包括炎症介质、凝血相关蛋白和血浆蛋白，以及组织环境依赖的神经和细胞外基质相关蛋白，表明FFPE来源的蛋白质组学谱保留了组织环境相关信号。细胞系独有蛋白则包括细胞周期和有丝分裂调控因子、代谢和线粒体酶、核糖体和RNA加工因子等，反映了培养细胞的高增殖和生物合成特征。经质量过滤后保留2186种蛋白质进行定量分析，主成分分析和层次聚类均显示FFPE组织与细胞系之间存在清晰分离，但组间平均蛋白质丰度呈强正相关（r=0.875）。差异丰度分析鉴定出大量显著差异蛋白，功能富集分析显示细胞系富集于RNA结合、翻译、rRNA加工、氧化磷酸化和糖酵解/糖异生等通路，而FFPE组织富集于细胞外囊泡、细胞外空间、角质化包膜、中间丝组织和细胞连接等与组织结构和微环境相关的功能类别。此外，流式细胞术验证了CD44和CD276在细胞系中的表达与质谱检测结果一致。
三、关键技术与方法
本研究采用的主要技术方法包括：基于病理医师指导的H&E染色数字切片肿瘤区域标注和Leica LMD7系统激光显微切割，从FFPE切片中精确分离肿瘤富集区域（每例采集8 mm2组织区域）；S-Trap?系统进行SDS蛋白提取和胰蛋白酶消化；Orbitrap Fusion质谱仪结合纳流反相液相色谱进行数据非依赖性采集（DIA）质谱分析；DIA-NN（v2.6.0）以无库模式进行蛋白质鉴定和定量；limma包进行差异丰度分析；STRING数据库进行功能富集分析。样本队列来源为日本神户儿童医院2018至2023年间的高危神经母细胞瘤FFPE标本，细胞系分别来自RIKEN生物资源研究中心、东北大学细胞资源中心和欧洲认证细胞培养物收藏中心。
四、研究结果
3.1 样本特异性蛋白质鉴定：FFPE样本鉴定出4511种蛋白质，细胞系鉴定出6812种，共有4311种。FFPE独有蛋白包括炎症、凝血和血浆相关蛋白及神经和细胞外基质相关蛋白；细胞系独有蛋白包括细胞周期调控因子、代谢酶和核糖体相关蛋白。神经母细胞瘤相关蛋白（NCAM1、TH、L1CAM）在FFPE样本中稳定检出，但残留血浆相关蛋白（ALB、FGB、C3等）也以较高丰度存在。
3.2 蛋白质组学数据质量评估：主成分分析显示FFPE组织与细胞系沿PC1（36.5%方差）清晰分离；组间平均蛋白质丰度呈强正相关（Pearson r=0.875）；样本间相关性分析显示组内高相似性；技术重复CV分析显示84.7%-97.8%的定量蛋白CV低于30%。
3.3 共有蛋白聚类分析：基于300个最高变异蛋白的层次聚类显示FFPE样本与细胞系完全分离。细胞系中，MYCN高表达细胞系（NH-12、CHP-134）与MYCN低表达细胞系（SK-N-AS、NB-69）分别聚类，而FFPE样本未按MYCN状态聚类。
3.4 差异蛋白丰度分析：在2186种定量蛋白中，中位绝对log?倍数变化为0.517。火山图显示FFPE富集蛋白主要涉及细胞外和结构组分，细胞系富集蛋白主要涉及细胞内生物合成和代谢过程。
3.5 功能富集分析：细胞系富集蛋白显著富集于RNA结合、翻译、rRNA加工、氧化磷酸化和糖酵解/糖异生通路；FFPE组织富集蛋白显著富集于细胞外囊泡、细胞外空间、角质化包膜、中间丝组织和细胞连接相关功能。
3.6 细胞表面蛋白表达比较：流式细胞术验证显示CD44在NB-69和SK-N-AS中高表达、在CHP-134和NH-12中低表达，与DIA-MS结果一致；CD276在四株细胞系中均检出，两种方法结果一致。
五、讨论与结论
研究人员指出，FFPE组织保留肿瘤特异性分化状态和微环境背景，而细胞系优先反映受控实验条件下的肿瘤内在程序。两种系统捕获神经母细胞瘤生物学中互补的方面，整合使用可为生物标志物发现和治疗靶点优先排序提供临床可解释的框架。研究的主要局限性包括FFPE病例数较少、细胞系数量有限、以GAPDH作为单一参考基因评估MYCN表达、以及FFPE组织与细胞系在固定、样本制备、蛋白输入量和细胞复杂性方面的固有差异导致生物学与技术贡献无法完全分离。研究结论表明，基于DIA的FFPE蛋白质组学在神经母细胞瘤中不仅技术上可行，而且具有生物学信息价值，与细胞系模型互补使用可支持儿科肿瘤学中回顾性生物标志物发现、分子特征描述和治疗靶点优先排序。
