《Diagnostics》：Comparative Detection of IDH1 R132H and TERT Promoter Mutations in Plasma and Cerebrospinal Fluid of Patients with Glioma Using Targeted Droplet Digital PCR
编辑推荐：
摘要
背景/目的：分子分型对于胶质瘤分类至关重要，但在某些情况下组织取样可能受限，而血浆和脑脊液（CSF）中循环游离肿瘤DNA（cftDNA）的可检测性报道差异很大。本研究旨在比较配对血浆和CSF样本中携带IDH1 R132H和TERT启动子（pTERT）C2
摘要
背景/目的：分子分型对于胶质瘤分类至关重要，但在某些情况下组织取样可能受限，而血浆和脑脊液（CSF）中循环游离肿瘤DNA（cftDNA）的可检测性报道差异很大。本研究旨在比较配对血浆和CSF样本中携带IDH1 R132H和TERT启动子（pTERT）C228T/C250T突变的cftDNA检出率及浓度，并探讨相关的临床特征。
方法：研究纳入66例世界卫生组织（WHO）1–4级胶质瘤患者，于术前入组。在可能造成组织损伤的操作前采集术前外周血和腰椎CSF。从5 mL血浆和2.5–5.0 mL CSF中分离循环游离DNA（cfDNA），并使用突变特异性微滴式数字PCR（ddPCR）进行检测。
结果：共获得65份CSF和63份血浆cfDNA样本。CSF中总cfDNA浓度低于血浆（中位数：434.1对1240.3拷贝/mL；p < 0.001）。然而，在14/65份CSF样本（21.5%）中检出了携带至少一种所测突变的cftDNA，而在血浆样本中未检出（0/63，0.0%）（p < 0.001）。IDH1 R132H在4.6%的CSF样本中检出，TERT启动子突变在16.9%中检出。所有可获得配对组织数据的CSF突变均在其对应肿瘤中得到了确认。WHO 4级胶质瘤和对比增强肿瘤与较高的CSF cfDNA、携带至少一种所测突变的cftDNA以及突变等位基因分数（MAF）值相关（p < 0.05），而肿瘤大小和定位与这些参数无显著相关性（p > 0.05）。
结论：在本研究所采用的靶向ddPCR工作流程下，腰椎CSF在检测所选胶质瘤相关突变方面比血浆更具信息价值。CSF cftDNA分析可作为组织分型的补充手段，但仍需更广泛的检测组合和更大规模的前瞻性研究来确定其临床灵敏度。
研究背景与问题提出
原发性脑肿瘤是一类异质性较强的肿瘤，其中胶质瘤是成人最常见的恶性原发脑肿瘤。近年来，分子遗传学特征已成为弥漫性胶质瘤诊断和临床管理的核心要素。世界卫生组织（WHO）第五版中枢神经系统肿瘤分类引入了整合组织学和分子特征的诊断方法。异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）基因的点突变，尤其是经典的IDH1 R132H取代，是早期致癌事件并定义了生物学上独特的胶质瘤亚群。端粒酶逆转录酶启动子（pTERT）基因的热点突变（C228T和C250T）则是成人弥漫性胶质瘤的另一重要分子特征，在IDH野生型胶质母细胞瘤和IDH突变伴1p/19q共缺失的少突胶质细胞瘤中尤为常见。
目前胶质瘤的分子分型主要依赖手术获取的肿瘤组织。然而，组织检测存在诸多局限：深部或功能区肿瘤的手术或立体定向活检困难或存在禁忌；即使获得组织标本，其数量和质量也可能不足以完成全面的分子检测；此外，胶质瘤存在显著的空间和时间异质性，单次活检难以代表所有遗传学不同的肿瘤区域，而治疗压力下的分子演变可能导致复发肿瘤与原发灶差异巨大。重复神经外科活检通常不可行，限制了组织分析对克隆进化和治疗耐药性的动态监测。
液体活检作为一种微创的肿瘤基因分型补充方法应运而生。在胶质瘤患者中，血浆和脑脊液（CSF）均被作为循环游离肿瘤DNA（cftDNA）的来源进行研究。血浆采集创伤小且易于重复，适合纵向监测。然而，血脑屏障（BBB）可能限制胶质瘤源性DNA进入体循环，加之非肿瘤来源cfDNA的大量稀释和快速清除，使得血浆中cftDNA的检出面临挑战。CSF在解剖位置上更接近脑肿瘤，理论上含有更高比例的cftDNA，尤其当肿瘤接触蛛网膜下腔时。多项研究表明CSF cftDNA能够再现肿瘤特异性的基因组改变，有时甚至比单一组织标本更全面地反映空间异质性和分子进化。但CSF采集比静脉穿刺更具侵入性，并非对所有患者都适用。
现有文献中关于胶质瘤患者cftDNA检出率的报道差异很大。多数基于测序的研究报告CSF的检出率远高于血浆，但不同研究间的方法学差异使比较变得复杂。因此，本研究旨在同一临床队列中，采用相同的分析方法，系统比较血浆和CSF中cftDNA的检出率和浓度，并探索影响cftDNA定性和定量特征的潜在因素。
研究方法概述
本研究为单中心研究，于2022年5月至2024年4月期间纳入66例WHO 1–4级胶质瘤患者。在术前约60分钟采集外周静脉血，并在手术开始时、任何可能损伤组织的操作之前，通过腰椎穿刺收集2.5–5.0 mL CSF。使用MagPure Circulating DNA Maxi Kit提取cfDNA。采用QX200 AutoDG微滴式数字PCR（ddPCR）系统，分别使用针对IDH1 R132H和pTERT C228T+C250T的突变特异性探针进行检测。ddPCR结果通过QuantaSoft 1.7软件分析，计算cftDNA浓度和突变等位基因分数（MAF）。
研究结果
3.1 血浆与CSF中cfDNA特征的比较
cfDNA样本来自65份CSF和63份血浆标本，其中62份为配对样本。CSF中总cfDNA浓度（以二倍体基因组当量计）显著低于血浆（中位数：434.1对1240.3拷贝/mL，p < 0.001）。相反，携带至少一种分析突变的cftDNA在CSF中的检出率显著高于血浆：CSF中为21.5%（14/65），而血浆中未检出阳性样本（0/63，0.0%）（p < 0.001）。相应地，CSF中cftDNA浓度和MAF的整体分布也显著高于血浆。
3.2 血浆、CSF和肿瘤组织中单个突变的检测
在具有配对肿瘤组织和CSF结果的患者中，IDH1 R132H和pTERT突变在CSF中的检出率分别为7.7%（2/26）和40.0%（2/5）。所有在CSF中检出的突变均在对应的肿瘤组织中得到确认，未发现CSF阳性而肿瘤组织阴性的情况。IDH1 R132H突变在血浆中未检出（0/63，0.0%），在CSF中检出率为4.6%（3/65），在肿瘤组织中为48.1%（26/54），三者间差异显著（p < 0.001）。pTERT C228T和C250T联合检出率在三种样本类型间也存在差异，但未达到统计学显著性阈值（p = 0.07）。
3.3 cfDNA特征与临床及人口学参数的关联
WHO 4级胶质瘤患者的CSF中总cfDNA浓度、cftDNA浓度和MAF均高于1–3级患者，而血浆总cfDNA浓度在两组间无显著差异。对比增强肿瘤患者的血浆和CSF中总cfDNA浓度均较高，CSF中cftDNA浓度和MAF也更高。CSF总cfDNA浓度与CSF MAF和cftDNA浓度呈中度正相关（Spearman's ρ = 0.58，p < 0.001）。肿瘤大小和解剖定位与血浆或CSF中的cfDNA参数均无显著相关性。
讨论与结论
本研究最突出的发现是，在所有63份血浆标本中均未检出携带IDH1 R132H或pTERT热点突变的cftDNA。这一结果与部分低血浆检出率的研究一致，但也与其他报告较高血浆敏感度的研究存在差异。血脑屏障可能是导致血浆阴性结果的重要因素，但不应被视为完全不可渗透的屏障——胶质瘤中存在空间异质性的血-肿瘤屏障，对比增强区域通透性增加，而浸润性非增强边缘可能保持相对完整的屏障特性。方法学因素也可能降低了血浆中的突变检出率，例如pTERT扩增子长度（160 bp）接近单核小体血浆片段长度，可能限制了在高度片段化cfDNA中的检测效率。此外，单次ddPCR反应中输入的模板量有限，在真实的低MAF情况下，预期平均不到一个突变模板进入反应。
相比之下，尽管CSF中总cfDNA浓度约为血浆的三分之一，但cftDNA在21.5%的CSF标本中被检出。CSF中含有较少的白细胞来源野生型DNA，有利于提高肿瘤分子的相对比例。本研究的CSF检出率低于一些使用肿瘤知情变异或多基因测序面板的研究，这可能与固定的三突变面板设计、未选择与CSF空间接触的肿瘤、以及未使用预扩增步骤有关。研究人员优先考虑了分析特异性而非灵敏度的提升。
肿瘤分级是与CSF cfDNA发现最密切相关的临床特征之一。WHO 4级胶质瘤通常表现出高细胞密度、增殖活性、凋亡和坏死增加、微血管增生以及侵袭性生长，这些均可促进DNA释放或进入细胞外液间隙。对比增强作为血-肿瘤屏障破坏的影像标志，也与更高的CSF cfDNA参数相关，反映了侵袭性、坏死性和高度血管化的表型。
本研究的主要优势包括配对术前采样、在组织损伤性操作前采集CSF、对两种体液采用相同的靶向分析方法、经过验证的检测体系，以及在可评估配对样本中未发现CSF阳性而组织阴性的不一致结果。局限性包括：单中心研究且样本量较小（66例）、综合WHO整合分子分类部分缺失、检测面板仅覆盖三个热点突变、部分参与者缺乏组织分型结果、以及横断面术前设计无法评估术后动力学和治疗反应。
结论翻译
在本研究中，通过ddPCR分析了配对术前血浆和腰椎CSF样本中的IDH1 R132H及pTERT C228T和C250T突变。尽管CSF中总cfDNA浓度（以二倍体基因组当量计）约为血浆的三分之一，但携带至少一种选定突变的cftDNA在21.5%的CSF样本中检出，而在血浆样本中未检出。此外，CSF中cftDNA浓度和突变等位基因分数显著更高。在可获得配对分子数据的患者中，CSF中检出的每个突变均在其对应肿瘤组织中得到确认，支持了所用靶向检测的特异性。
CSF cfDNA的定量特征还与临床相关的肿瘤特征相关联。WHO 4级胶质瘤患者的CSF总cfDNA浓度、cftDNA浓度和突变等位基因分数高于1–3级患者。在对比增强肿瘤患者中也观察到类似的关联。同时，肿瘤大小和解剖定位与所评估的cfDNA参数无显著相关性。这些发现提示，cftDNA向CSF的释放可能更多地受生物学侵袭性、细胞更新、坏死、血管异常和组织屏障破坏的影响，而非单纯的肿瘤大小或脑叶定位。
总体而言，在单中心队列、不完全的组织分子分型以及仅分析三个预设热点突变的限制下，本研究的主要发现是：在所采用的ddPCR工作流程中，腰椎CSF在检测胶质瘤源性DNA方面比血浆更具信息价值。血浆中未检出目标突变不应被解释为胶质瘤源性DNA完全不存在于循环中，因为低模板输入量和有限的突变面板可能限制了cftDNA的检出产量。基于CSF的ddPCR可能成为胶质瘤靶向分子表征的有用补充方法，尤其在无法获得合适肿瘤组织时，但目前尚不能替代全面的组织分型。需要进行更大规模的前瞻性多中心研究，纳入完整的配对组织基因分型、更广泛的多重检测面板、更短的扩增子、增加的分子输入量、重复反应、标准化的CSF处理流程以及纵向采样，以确定CSF cftDNA分析的诊断和监测应用价值。
