增殖细胞中组蛋白H3K27甲基化状态的顺序催化机制

《Cell Reports》：Histone H3K27 methylation states are sequentially catalyzed in cycling cells

在多梳蛋白(Polycomb)结构域中，组蛋白H3第27位赖氨酸(H3K27)的三甲基化(H3K27me3)标记沉默基因，但在增殖细胞的DNA复制后，这种甲基化如何维持尚不清楚。本研究采用切割与靶向标签化(CUT&Tag)染色质分析方法追踪人类细胞中H3K27甲基化的动态变化。研究人员发现，多梳结构域中的三甲基化是通过DNA复制后的逐步甲基化来维持的。在多梳结构域之外，数千个转录失活基因在DNA复制数小时后获得组蛋白H3K27二甲基化(H3K27me2)。急性使用多梳抑制复合物2(PRC2)组蛋白甲基转移酶的小分子抑制剂会减缓细胞周期S期中的H3K27甲基化，并增加该残基的乙酰化。这种效应在早S期复制的多梳结构域中最为显著，表明早期复制和缓慢的组蛋白甲基化为发育沉默基因赋予了可塑性。总之，这些结果解释了H3K27修饰模式如何在快速增殖细胞中被忠实复制。

研究背景与科学问题

表观遗传信息的忠实传递是细胞分裂过程中维持基因表达状态的关键。组蛋白H3第27位赖氨酸(H3K27)的甲基化修饰是形成兼性异染色质的重要标志，其中H3K27三甲基化(H3K27me3)富集于多梳蛋白(Polycomb)结构域，介导发育相关基因的稳定沉默；而H3K27二甲基化(H3K27me2)则广泛存在于基因组非活跃区域，占所有组蛋白H3尾巴的50%-70%。尽管已知多梳抑制复合物2(PRC2)负责催化从无甲基化到单甲基化(H3K27me1)、再到H3K27me2、最终至H3K27me3的逐步甲基化过程，且其最后一步受邻近核小体上H3K27me3标记的变构激活调控，但一个根本性问题尚未解决：在DNA复制和染色体倍增过程中，H3K27me2和H3K27me3标记如何被传播以实现可遗传的基因沉默？以往研究表明哺乳动物中H3K27me3的恢复十分缓慢，甚至无法在S期内完成，这挑战了PRC2直接在复制叉处将修饰传播给新合成组蛋白的经典模型。然而，H3K27me1和H3K27me2在细胞周期中的催化动力学此前从未被系统解析。

研究内容与核心结论

为解答上述问题，研究人员利用切割与靶向标签化(CUT&Tag)染色质分析方法，在人红白血病K562细胞系中对细胞周期各阶段的三种H3K27甲基化状态进行高分辨率动态追踪。研究得出以下核心结论：第一，多梳结构域中H3K27me3的维持依赖于DNA复制后的逐步甲基化过程——新沉积的未修饰组蛋白首先迅速获得H3K27me1，随后转化为H3K27me2，最后经数小时延迟才缓慢转变为H3K27me3；第二，在多梳结构域外，数千个转录不活跃的基因在DNA复制后同样经历逐步甲基化，但止步于H3K27me2而不再继续转化为H3K27me3；第三，PRC2的催化抑制和变构抑制均能显著延缓S期中H3K27me1和H3K27me2的出现，同时导致H3K27乙酰化(H3K27ac)水平上升；第四，H3K27me2修饰并不具备普遍的转录抑制功能，它仅是转录不活跃染色质的被动产物；第五，早S期复制的基因表现出最剧烈的甲基化动态变化，且多梳结构域中早复制的基因会在二甲基化发生前短暂获得活性RNA聚合酶II(RNAPII)，表明缓慢的甲基化恢复为发育沉默基因提供了转录可塑性的时间窗口。

关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术：1）荧光激活细胞分选(FACS)结合DNA染料DRAQ5对K562细胞进行S期六阶段精细分选，每阶段代表约2.5-3小时的细胞周期进程；2）CUT&Tag染色质分析方法，使用经合成核小体验证的高度特异性抗体分别检测H3K27me1、H3K27me2、H3K27me3、H3K27ac和活性RNAPII在分选后各细胞周期阶段的染色质分布；3）使用PRC2催化抑制剂EPZ-6438和变构抑制剂EED-226进行8小时急性处理，结合S期分选和CUT&Tag分析药物对甲基化动力学的即时影响；4）整合公开的GRO-cap、SuRE和TRIP等多组学数据评估H3K27me2修饰区域的启动子活性及其对整合外源启动子的抑制能力。

研究结果详述

稳态分布特征：CUT&Tag分析显示，K562细胞中H3K27me3、H3K27me2和H3K27me1三种甲基化状态标记着截然不同的基因组区域。多梳结构域富含H3K27me3但缺乏H3K27me1和H3K27me2，活跃基因富含H3K27me1和H3K27ac，而基因间区则富集H3K27me2。相关性分析表明，H3K27me3和H3K27me2均与活性RNAPII呈负相关，而H3K27me1则与转录活性正相关。

多梳结构域中的逐步甲基化：通过对S期六个分选组分进行CUT&Tag分析，研究人员发现早复制多梳结构域基因在S1和S2组分中H3K27me3信号降至最低，随后缓慢恢复。引人注目的是，H3K27me1在复制后立即出现短暂的波峰，H3K27me2则在1-2个组分后紧随其后出现，随后两者均逐渐消退。这种时序模式完美符合PRC2在新合成组蛋白上的分布性催化模型：快速产生H3K27me1→转化为H3K27me2→最终缓慢转化为H3K27me3。

高H3K27me3占有率驱动结构域恢复：通过分析MTF2（PRC2辅助因子，锚定于CpG岛）的染色质占据，研究人员定义了多梳结构域内的成核位点和扩散位点。结果显示，成核位点的H3K27me3恢复速度显著快于低覆盖度的扩散位点，且高H3K27me3覆盖度的扩散位点恢复最快，这与PRC2变构激活机制一致。

多梳结构域外的逐步甲基化：在多梳结构域外，H3K27me2富集基因和H3K27me1富集基因在DNA复制后同样经历逐步甲基化。H3K27me2基因出现H3K27me1→H3K27me2的转换但不继续向H3K27me3转化；H3K27me1基因则停留在H3K27me1水平而不进一步二甲基化。

早S期甲基化动态最为剧烈：通过计算S期组分间的绝对差异值(ΔRPKM)，研究人员发现早S期复制的基因无论在多梳结构域内还是外都表现出最显著的H3K27甲基化循环变化，而晚S期复制的基因动态减弱。这表明早S期的开放染色质环境有利于PRC2催化，而晚S期密集的异染色质可能增强PRC2变构激活从而加速H3K27me3的积累。

PRC2抑制延缓细胞周期中的H3K27甲基化：8小时EPZ-6438或EED-226处理显著延迟了多梳结构域中H3K27me1和H3K27me2的出现约4个组分，但对H3K27me3的影响较小。线性回归分析证实，药物效应与复制时序之间存在显著关联，早复制基因受抑制最明显。两种抑制剂均导致H3K27ac水平升高，其中催化抑制剂EPZ-6438的作用更快，表明PRC2本身可能通过占据H3K27残基来阻止乙酰化。

H3K27me2标记转录不活跃染色质：GRO-cap和SuRE分析显示，H3K27me2富集基因的启动子在天然染色质环境中活性极低，且当其脱离天然环境转入质粒后活性依然很低，表明这些启动子本身缺乏内在活性。TRIP实验表明，将外源启动子整合入H3K27me2标记区域后，大多数启动子并未受到显著抑制，证明H3K27me2本身不具备广泛的转录抑制功能。此外，早复制多梳结构域基因在H3K27me2催化前会短暂获得活性RNAPII，暗示缓慢的甲基化恢复为基因激活提供了机会窗口。

讨论与结论总结

本研究表明，H3K27me3在增殖细胞中的忠实传播并不需要在复制叉处立即对新组蛋白进行三甲基化，而是通过PRC2在多梳结构域内的高局部密度维持逐步催化来实现。具体而言，亲代H3K27me3标记的核小体正向强化PRC2定位，维持有利于持续顺序催化的局部染色质环境。在多梳结构域外，较低的PRC2密度仍足以催化产生稳定的H3K27me2标记。关于H3K27ac的调节，研究发现PRC2催化抑制比变构抑制更快地允许H3K27ac增加，这可能是因为变构抑制下PRC2仍能结合底物从而物理屏蔽乙酰化。研究结论指出：H3K27修饰模式在快速增殖细胞中的忠实复制是通过DNA复制后数小时的逐步甲基化实现的，这一机制赋予了发育沉默基因特别是早S期复制基因以转录可塑性，同时解释了H3K27me2作为最丰富组蛋白修饰之一的广泛分布及其非抑制性功能。