线粒体碳酸酐酶-VB（CA-VB）选择性抑制改善阿尔茨海默病模型中的脑微血管内皮应激、血脑屏障功能障碍与记忆损害

《SCIENCE ADVANCES》：Mitochondrial carbonic anhydrase–VB inhibition rescues brain endothelial stress and memory in Alzheimer’s disease models

　　

阿尔茨海默病（AD）是一种破坏性神经退行性疾病，尚无有效治愈方法，其特征为聚集的淀粉样β（Aβ）和过度磷酸化tau在脑实质和血管中积累。脑血管和线粒体功能障碍是AD进展中的早期因果事件。既往研究支持抑制碳酸酐酶（CAs）可能预防AD模型中的线粒体和脑血管功能障碍。在此，研究人员通过药理学和遗传学操作在人脑微血管内皮细胞（hCMEC）中选择性靶向线粒体CA同工型CA-VB，并在AD小鼠中确认CA-V抑制剂具有保护作用。CA-V抑制和CA-VB敲除（KO）可预防Aβ诱导的线粒体介导的内皮细胞凋亡、屏障电阻丧失和hCMEC炎症激活。值得注意的是，CA-V抑制还减轻3xTg AD小鼠脑中的半胱天冬酶（caspase）激活和内皮细胞激活，从而保留记忆功能。研究结果表明，选择性CA-V抑制是针对AD介导的脑血管病理、神经炎症和认知损害的有效且有前景的策略。

论文解读

一、研究背景与科学问题

阿尔茨海默病（AD）是最常见痴呆形式，全球超过5500万人受累，年龄是最常见风险因素。AD特征为细胞外淀粉样β（Aβ）聚集体及神经元内过度磷酸化tau缠结在包括海马和皮层等多个脑区积累。近年来，靶向Aβ以促进清除的抗体已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于AD治疗，但其存在淀粉样相关影像异常（ARIAs）等值得关注的副作用，且仅部分改善认知损害，因此仍无有效治愈方法。脑血管衰退，包括脑血流量（CBF）下降和血脑屏障（BBB）通透性增加，是AD发病机制中最早的因果事件之一，并进一步影响神经血管单元（NVU）中的胶质细胞和神经元等。NVU由脑内皮细胞（CECs）、周细胞/平滑肌细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元组成。脑淀粉样血管病（CAA）即聚集Aβ在脑血管周围和内部积累，约见于90% AD患者。Aβ在脑血管沉积可通过影响线粒体代谢、氧化应激、细胞死亡和神经炎症等机制导致并加重NVU功能障碍。人AD脑单细胞转录组学已显示微血管CEC中凋亡通路上调。Aβ40更易在血管积累，Aβ42更易在实质斑块沉积；Dutch突变AβQ22聚集更快、毒性更高，可用于CAA毒性细胞模型。既往研究显示，FDA批准的非选择性pan-碳酸酐酶（CA）抑制剂乙酰唑胺（ATZ）和甲唑胺（MTZ）可改善淀粉样变模型中线粒体介导的细胞死亡和应激。研究人员近期观察到线粒体同工型CA-VB在Aβ处理CEC、TgSwDI CAA小鼠模型以及人AD和AD+CAA脑中表达增加。由于pan-CA抑制剂缺乏选择性，长期使用存在担忧，而4ITP对CA-V具有较强选择性。因此，研究人员假设选择性抑制线粒体CA-V可保护Aβ诱导的CEC线粒体介导凋亡和NVU应激，减少认知损害并减少pan-CA抑制剂脱靶效应。该研究在CEC和3xTG AD小鼠模型中检验该假设，论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

二、主要关键技术方法

研究人员采用选择性CA-V抑制剂4ITP和CRISPR-Cas9介导的CA-VB KO人脑微血管内皮细胞（hCMEC/d3；由Babette Weksler, Cornell University提供；CA-VB KO细胞由EditCo Bio Inc.生成）。以Aβ40-Q22处理细胞，采用ECIS Zθ检测跨内皮电阻，Western blot、免疫荧光、ELISA、Amplex Red、MSD细胞因子和TaqMan qPCR阵列评估凋亡、线粒体功能、屏障和炎症。体内使用雄雌3xTG AD小鼠，6至16月龄经饮食给予4ITP 20 mg/kg/day；进行Barnes迷宫、恐惧条件化、新物体识别、旷场和rotarod；脑组织行免疫组化、TUNEL及Aβ/tau ELISA。

三、研究结果

CA-V抑制减少CEC中Aβ诱导线粒体介导的凋亡。研究人员用AβQ22 25 μM单独或联合4ITP 1、10、30 μM处理hCMEC 24小时或16小时。10和30 μM 4ITP显著保护hCMEC免于AβQ22诱导的DNA断裂和活力丧失，降低caspase-9激活及caspase-3/-7阳性细胞。10 μM 4ITP防止AβQ22诱导的线粒体膜电位（ΔΨ）丢失和细胞色素C（CytC）释放，阻止BAX和Bim增加，但不显著改变BCL-2或BAK；同时降低线粒体H₂O₂产生和4-HNE水平。

CA-V抑制防止Aβ驱动的内皮屏障完整性丧失。研究人员用亚致死浓度10 μM AβQ22处理hCMEC，通过ECIS Zθ测屏障电阻。10和30 μM 4ITP剂量依赖性防止AβQ22诱导的电阻下降，并使电阻高于对照；4ITP单独也增加电阻。4ITP单独或联合AβQ22在6小时和24小时增加claudin-5表达。48小时AβQ22降低occludin表达，4ITP使其不再显著；30 μM 4ITP单独增加occludin表达。

CA-V抑制防止Aβ启动的内皮激活。10 μM AβQ22处理hCMEC后，6小时ICAM-1显著增加，24和48小时VCAM-1显著增加。4ITP使6小时ICAM-1增加降至与对照无显著差异，并在24和48小时剂量依赖性恢复VCAM-1。6小时AβQ22降低抗炎IL-10释放，4ITP逆转；IL-6增加不受4ITP影响。48小时AβQ22降低IL-10并增加IL-6、IL-12p70和IL-4，4ITP上调IL-10并降低IL-6、IL-4和IL-12p70。24小时qPCR显示AβQ22增加VCAM-1、CXCL2、CSF3/G-CSF、IL-12a/b、IL-4、IL-6和E-selectin；CA-V抑制降低CXCL2、CSF3、IL-12b、IL-4和E-selectin，增强IL-10，并降低CXCL1、CSF2/GM-CSF和P-selectin。

CA-VB KO防止Aβ诱导的CEC凋亡和屏障电阻丧失。研究人员使用CRISPR-Cas9 CA-VB KO hCMEC，确认CA-VB几乎完全敲除而CA-VA和CA-II仍表达。25 μM AβQ22处理24小时，CA-VB KO细胞未出现WT细胞中显著的DNA断裂增加，caspase-3/-7激活完全被防止；16小时AβQ22诱导的ΔΨ丢失和CytC释放被防止，线粒体H₂O₂产生也受保护。10 μM AβQ22下，CA-VB KO细胞屏障电阻显著保留，但仍有轻微下降，可能因KO不完全或CA-VA等其他因素参与。4ITP在CA-VB KO细胞中仍可提高电阻至对照水平，符合其同时抑制CA-VA和CA-VB。

体内CA-V抑制减少凋亡和BBB完整性丧失，防止神经元丢失和认知衰退。3xTG雄雌小鼠从6月龄至16月龄经饮食接受4ITP 20 mg/kg/day。4ITP降低海马和皮层总体caspase-3表达及DAPI⁺ DNA断裂；海马caspase-3与CD31共定位阳性血管增加，4ITP后与WT无显著差异；CD31面积在海马显著降低、皮层呈类似趋势，4ITP防止内皮细胞丢失；海马和皮层血管直径降低，4ITP逆转。海马和皮层VCAM-1、ICAM-1表达增加，4ITP降低；海马occludin降低，4ITP部分缓解至与WT无显著差异；皮层4ITP增加occludin。3xTG海马出现白蛋白渗漏，4ITP小鼠未见。4ITP预防3xTG皮层IL-10下降趋势和IL-4下降；KC-GRO/CXCL1和MIP-2/CXCL2增加趋势被缓解；GFAP面积在4ITP后降低；4-HNE无显著变化。海马NeuN面积在3xTG降低，4ITP显著增加；NeuN与CD31面积呈正相关；皮层NeuN与cleaved caspase-3共定位在3xTG增加，4ITP降低。雌性3xTG海马可溶和不可溶Aβ40显著降低，不可溶pTau231降低；前额叶皮层可溶和不可溶Aβ42显著降低，可溶Aβ40呈趋势降低，pTau231无显著变化。Barnes迷宫显示6至16月龄长期4ITP治疗较12至16月龄更有效；治疗组训练日表现改善，探针日错误数和潜伏期降至WT水平，WT+4ITP无空间记忆损害。恐惧条件化中3xTG冻结时间减少，4ITP恢复；旷场和rotarod无显著运动差异，4ITP组中心时间呈增加趋势；新物体识别中3xTG探索新物体时间减少，4ITP增加。性别分析显示部分差异不显著，但雄雌探针潜伏期均改善，雌性错误数改善更显著，雄雌线索恐惧记忆均恢复，雄性新物体识别和rotarod改善显著。

四、讨论与结论

讨论认为，线粒体CA-V是治疗AD、CAA及相关脑血管病理的有希望靶点。4ITP比ATZ和MTZ更亲脂且对CA-V更具选择性，可防止AβQ22诱导的内皮细胞线粒体介导凋亡、caspase-9激活、CytC释放、ΔΨ丢失、线粒体活性氧产生、hCMEC屏障电阻丧失和内皮炎症激活。通过CA-VB CRISPR KO细胞，研究机制性确认CA-VB是AβQ22诱导内皮线粒体介导凋亡、氧化应激和屏障完整性丧失所必需。研究人员预期CA-V抑制剂和CA-VB KO也可能保护WT Aβ40诱导的类似机制，但需进一步研究。4ITP在3xTG小鼠中防止凋亡、脑血管功能障碍和炎症激活，减少AD病理并改善记忆。脑血管和线粒体功能障碍是衰老相关疾病早期因果事件，可早于Aβ和tau积累并形成清除受损、毒性蛋白积累、神经炎症和脑血管/线粒体代谢缺陷的恶性循环。当前FDA批准AD治疗不改善脑血管功能，抗Aβ抗体可增加BBB上Aβ沉积并导致ARIA-E或ARIA-H。线粒体靶向治疗尚未获FDA批准。CA催化CO₂水合生成碳酸氢盐和质子，对维持细胞尤其线粒体生理健康重要。pan-CA抑制剂ATZ和MTZ为较极性 legacy 利尿剂，已批准用于青光眼、癫痫和高原病等，并在肥胖、脑水肿、卒中和糖尿病诱导脑血管病理模型中有效，但缺乏选择性，系统使用需较高剂量并产生不良效应。高剂量ATZ可急性抑制小鼠长时程增强，人类高浓度ATZ报告记忆下降，可能与海马锥体神经元高表达的CA-VII有关。本研究ATZ和4ITP剂量20 mg/kg/day相当于人2.6 mg/kg/day，低于FDA批准CAI剂量；WT动物长期4ITP不损害空间记忆。6月龄开始治疗比12月龄开始更有效，提示CA-V抑制靶向早期脑血管、线粒体功能障碍和神经炎症。CA-VB在脑内更丰富，Car5B全身KO小鼠可存活、生长正常、血氨正常，提示慢性抑制CA-VB或KO无毒性。CA-VB KO完全防止Aβ诱导凋亡并部分减轻屏障电阻丧失；4ITP完全恢复屏障电阻，提示CA-VA或其他CA同工型也可能参与BBB通透性。机制上，抑制线粒体CA活性预计减少应激时质子过产生，维持线粒体基质较低H⁺浓度，保护ΔΨ和质子动力，尤其在活性氧存在时。4ITP处理在hCMEC和小鼠皮层中保存抗炎IL-10，降低VCAM-1、ICAM-1及CXCL2/MIP-2，减少免疫细胞外渗和慢性炎症。3xTG治疗雌鼠海马Aβ40和pTau231降低，可能与脑血管功能保存、神经炎症减少和清除改善有关。研究局限包括无法实现完全药理选择性；未实时测BBB功能或CBF；未聚焦4ITP对小胶质细胞影响；未充分探讨对神经元直接效应、其他细胞死亡通路及新鲜脑组织线粒体功能和氧化应激。总体而言，该研究开创性证明选择性CA-V抑制在淀粉样变和AD模型中的保护作用。

研究结论翻译：总体而言，本研究在证明选择性CA-V抑制在淀粉样变和AD模型中的保护作用方面具有开创性。研究人员已表明，CA-V抑制剂4ITP和CA-VB CRISPR KO可保护CEC免受Aβ诱导的线粒体介导凋亡和BBB功能障碍，并且4ITP可有效挽救3xTG小鼠的脑凋亡、内皮细胞存活、脑血管和神经免疫功能以及认知损害。总之，CA-V抑制剂的开发和测试以及理解线粒体CA-VB的作用，是针对AD、CAA、ADRD以及血管性认知损害和痴呆中的脑血管病理和线粒体功能障碍进行治疗性靶向的关键研究领域。