光刺激δL法绘制成熟丘脑与皮层电突触网络图谱

《SCIENCE ADVANCES》：Photomapping electrically coupled networks of the mature thalamus and cortex

　　

电突触在脑内广泛表达，是活跃神经环路与连接组的关键组分。活体组织中耦合网络的鉴定受限于多通道记录的技术要求，目前尚无染料、荧光报告蛋白或遗传标记可弥补这一空白。研究人员提出一种鉴定和量化电突触的新方法opto-δL，该方法将靶向胞体的视蛋白焦光电刺激与基于放电时序的电突触强度计算相结合，用于在体外快速测量和绘制电耦合网络。研究人员利用opto-δL表明，成熟丘脑网状核(TRN)的耦合网络可延伸达100 μm，跨神经元遗传亚型泛连接，每个被记录枢纽细胞耦合1至4个邻近神经元。研究人员将opto-δL应用于皮层网络，发现体生长抑素(SOM)神经元耦合更强且更普遍。这些结果凸显了opto-δL在环路、行为与认知中探询电突触身份和作用的广泛潜力。

研究背景方面，化学突触与电突触共同构成脑内神经元间通信基础。电突触由间隙连接(gap junction, GJ)形成，可双向传递任意大小、极性和时程的信号，成熟哺乳动物神经元GJ多由连接蛋白36(connexin36, Cx36)构成，广泛表达于GABA能神经元。化学突触及其网络已被精细描述，而电突触传输和网络功能描述有限。金标准配对记录耗时、低通量且限于体外单突触；染料耦合不能区分初级与次级连接、无法量化强度且限于固定组织；现代连接组几乎忽略电突触。丘脑网状核(thalamic reticular nucleus, TRN)为GABA能核团，向感觉丘脑中继核提供主要抑制，其神经元亚型在空间与遗传上分明；既往配对记录受睁眼后髓鞘化阻碍，仅限幼龄组织，因此成年TRN电突触是否持续贡献丘脑皮质中继存疑。该研究发表于《SCIENCE ADVANCES》。

关键技术方法方面，研究人员以SOM-Cre与PV-Cre小鼠为样本队列，幼龄与成年个体经立体定位注射AAV9-CAG-DIO-ChroME-st-P2A-H2B-mRuby使神经元表达胞体靶向视蛋白st-ChroME；采用单电极全细胞膜片钳记录枢纽细胞，用数字镜装置对单个胞体进行560 nm焦光电刺激，以rheobase电流驱动枢纽细胞放电，比较单独rheobase与叠加邻近神经元光刺激后的首发峰潜伏期，计算δL；以等距空白位点光散射作对照，或用散射等效电流校正注入电流；另用PV-Cre-Cas9小鼠注射sgRNA病毒敲低Cx36或胶质表达的Cx29作验证对照。

RESULTS部分，研究人员先在幼龄配对神经元验证opto-δL：以传统耦合系数(coupling coefficient, cc)作基准，对邻近细胞焦光电刺激使枢纽细胞峰延迟缩短，空白散射对照校正后δL与cc一致，证明单电极加视蛋白光刺激可鉴定电突触。随后Cx36敲低队列中，opto-δL检出的耦合率远低于Cx29敲低对照，且Cx36敲低下存留突触细胞出现spikelet，验证方法依赖Cx36介导的GJ。成年TRN中，研究人员在SOM-Cre与PV-Cre小鼠切片记录95个枢纽细胞、测试501个连接，发现SOM⁺同源网络21个、SOM^?/SOM⁺异源网络4个、PV⁺同源网络14个；SOM⁺平均δL为25.7%，异源15.9%，PV⁺为19.4%，各亚型强度无显著差异；PV⁺耦合发生率28.8%高于SOM⁺的16.0%与异源7.3%；耦合平均胞体间距41.7 μm，网络最远达100 μm，且距离越近耦合越强。皮层初级体感区中，SOM⁺皮层网络平均δL 44.8%，高于TRN中SOM⁺；PV⁺皮层耦合发生率9.4%低于SOM⁺的40.0%，与TRN中PV更密偶联相反，说明电耦合配置随脑区定制。

DISCUSSION部分，研究人员指出opto-δL首次在活体组织直接证明成年TRN功能电突触持续存在，并揭示同源与异源GABA能TRN神经元形成小尺度选择性网络，而非染料耦合提示的大网络；TRN电突触可能是并行丘脑皮质通道间唯一丘脑内连接。PV⁺高频耦合若反映其投射至一级丘脑，则意味着一级中继回路中TRN协调更广。opto-δL较配对记录可测更远连接，但主要捕获直接连接；网络规模为每枢纽1至4个直接突触，属功能相关耦合。方法局限包括cc与δL无线性换算、亚阈值非线性与静息电位影响、光散射与视蛋白非完全胞体限制、切片切断连接与未转染细胞导致低估。

结论部分翻译：Cx36在成熟哺乳动物脑内广泛表达，但活体组织中电耦合网络的功能测量与图谱仍缺失。研究人员在此引入活体组织网络绘制新方法opto-δL，其利用靶向胞体视蛋白神经元的光刺激，并结合因跨电突触共享兴奋所产生的、含显著性检验的放电时序变化测量。借助opto-δL，研究人员直接证明TRN中功能电突触持续至成年，此前仅见spikelet与Cx36表达等间接证据。研究人员还证明成年GABA能TRN神经元在不同分子亚型间以同源与异源电网络耦合，且比双细胞记录所识更远；opto-δL绘出的TRN直接电连接网络比染料耦合提示的网络小得多，意味着成熟TRN电突触通过网络规模为选择性的方式，为丘脑皮质通路提供连接。