《SCIENCE ADVANCES》：A B1 SINE element within the mouse Malat1 long noncoding RNA acts as an internal ribosome entry site mediating micropeptide translation
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在大多数细胞中，Malat1长非编码RNA定位于细胞核，影响剪接和染色质功能。在小鼠神经元中，Malat1被输出至细胞质，并在其中被翻译生成M1微肽。本研究中，研究人员鉴定了一个M1翻译所必需的内部核糖体进入位点（IRES），该位点足以诱导下游开放阅读框的非帽
在大多数细胞中，Malat1长非编码RNA定位于细胞核，影响剪接和染色质功能。在小鼠神经元中，Malat1被输出至细胞质，并在其中被翻译生成M1微肽。本研究中，研究人员鉴定了一个M1翻译所必需的内部核糖体进入位点（IRES），该位点足以诱导下游开放阅读框的非帽依赖性表达。体内化学探针和结构建模确定了一个三茎环RNA二级结构，该结构包含活性IRES区段，并与小鼠B1短散在核元件（SINE）重复序列重合。在亲和纯化实验中，一个最小IRES/B1 RNA选择性结合核糖体亚基、翻译因子以及已知的IRES辅因子Rack1和hnRNP A2/B1。敲低Rack1和hnRNP A2/B1可抑制报告基因的IRES依赖性翻译以及内源M1肽的表达。本研究在一个被广泛研究的长非编码RNA中揭示了一个意想不到的功能单元。
长非编码RNA（lncRNA）曾被视为缺乏编码能力的转录本，但近年研究发现部分lncRNA含有编码微肽的短开放阅读框。Malat1是一种广泛表达于细胞核、影响剪接和染色质功能的lncRNA。研究人员此前发现，小鼠Malat1在皮层神经元中可转运至细胞质，与核糖体结合并翻译生成M1微肽，且M1翻译受去极化刺激，敲低Malat1或阻断M1翻译会导致突触蛋白表达增强，表明M1可能抑制生理反应。然而，Malat1缺乏典型mRNA的特征，如剪接和polyA尾，其M1开放阅读框（ORF）的起始密码子位于5'端帽子下游739个核苷酸处，且前方存在多个起始密码子。因此，M1如何起始翻译是一个关键问题。本研究旨在鉴定M1翻译所需的顺式调控序列并阐明其作用机制。
研究人员通过一系列报告基因和突变分析，发现M1翻译依赖于5'非翻译区（UTR）内一段与B1短散在核元件（SINE）重叠的RNA结构。利用四碱基体内化学探针（fbDMS-MaP）和结构建模，确定该区域形成三个茎环（P1、P2、P3），构成一个功能性内部核糖体进入位点（IRES）。RNA亲和纯化结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定出与IRES结合的核糖体蛋白和翻译因子，并通过小干扰RNA（siRNA）敲低和过表达实验验证了关键辅因子Rack1和hnRNP A2/B1对IRES活性和内源M1肽表达的必要性。主要技术方法包括：在BV2细胞中对内源Malat1进行fbDMS-MaP探针，并使用SuperFold进行二级结构建模；在N2a神经母细胞瘤细胞中采用双顺反子报告基因检测IRES活性；利用链霉亲和素RNA适配体（3xS1m）进行亲和纯化后质谱分析；通过siRNA敲低和质粒过表达验证蛋白功能。研究中使用的细胞系包括小鼠N2a、BV2和人胚胎肾293细胞，未涉及临床样本。
**小鼠Malat1 M1 ORF的翻译需要上游调控序列**：研究人员构建M1-绿色荧光蛋白（GFP）融合报告基因，在N2a细胞中进行100核苷酸（nt）逐段删除突变。结果显示，删除440–539、540–639和640–739片段显著降低GFP表达，而删除1–139、240–339和340–439则增加表达。为排除定位效应，研究人员使用GFP-红色荧光蛋白（RFP）双顺反子报告基因，将Malat1 5'UTR插入两ORF之间，发现全长5'UTR可驱动RFP表达，而删除440–539和540–639削弱活性。通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和RNA干扰实验排除了隐蔽剪接、隐蔽启动子和截短转录本的干扰，证实该活性来自IRES。
**小鼠Malat1 RNA中M1翻译所需序列在体内形成稳定的二级结构**：研究人员对BV2细胞内源Malat1进行fbDMS-MaP探针，结合SuperFold预测，确定了一个约150 nt的低反应性区域（550–700），由P1、P2、P3三个茎环组成。该区域与B1 SINE（556–703）重合。最小IRES（558–695）单独即可驱动RFP表达，删除P1或P3严重降低活性，删除P2部分降低；而仅含单个茎环或部分组合的片段无活性。对报告基因转录本进行fbDMS-MaP，确认其结构与内源RNA一致。体外转录的双顺反子RNA（不带甲基化帽）转染实验表明，Malat1 IRES与脊髓灰质炎病毒（Polio）和丙型肝炎病毒（HCV）IRES类似，能独立于核转录和加工驱动下游ORF翻译，且活性约为Polio IRES的三分之一，略低于HCV IRES。
**小鼠Malat1 IRES与核糖体亚基和翻译因子结合**：研究人员将最小IRES及突变体（缺失P1或P3）与3xS1m适配体融合，进行RNA亲和纯化，结合LC-MS/MS鉴定差异结合蛋白。与反向序列对照相比，完整IRES富集到59个蛋白，包括大量核糖体蛋白（如Rps11、Rps14）和翻译因子，基因本体（GO）分析富集于核糖体相关功能。缺失P1导致包括hnRNP A2/B1、Rack1、SRP9/SRP14在内的多个蛋白结合丧失，而缺失P3仅部分改变结合谱。免疫印迹验证了Rps14、Rps11、hnRNP A2/B1和Rack1的特异性结合。
**IRES结合蛋白Rack1和hnRNP A2/B1是Malat1 IRES活性所必需的**：siRNA敲低Rack1使双顺反子报告基因的RFP表达下降约75%，而不影响上游GFP；过表达Rack1则使RFP表达升高约三倍，且单细胞荧光显示Rack1水平与RFP强度正相关（r=0.823）。敲低hnRNP A2/B1同样抑制IRES驱动的RFP表达。此外，在N2a细胞中敲低Rack1或hnRNP A2/B1均显著降低内源M1肽的免疫荧光信号，表明内源M1翻译依赖这两个辅因子。由此提出核糖体通过IRES及其结合蛋白被招募至M1起始密码子的模型。
**讨论与结论**：本研究鉴定了一个由B1 SINE元件构成的功能性IRES，该元件在小鼠Malat1中驱动M1微肽的非帽依赖性翻译。B1 SINE是啮齿类特异的重复元件，与人类Alu元件同源，此前未报道其具有IRES活性，但Alu RNA可结合80S核糖体。Malat1 IRES的体内二级结构与B1 SINE的已知结构一致，且保留了SRP9/SRP14结合位点。Rack1和hnRNP A2/B1在IRES功能中起关键作用，类似它们在HCV等其他IRES中的功能。Malat1兼具3'端三螺旋结构和5'端IRES，使其无需典型mRNA的5'帽和polyA尾即可翻译。该发现揭示了lncRNA中隐藏的翻译调控元件，为理解非编码RNA的功能多样性提供了新视角。研究结论是：小鼠Malat1 RNA中的B1 SINE元件形成IRES，通过结合核糖体和特定辅因子导M1微肽翻译；该IRES是内源M1表达所必需的，且可能代表一类未被发现的SINE相关翻译调控单元。
