利用原子力显微镜进行定量纳米级质谱分析的系统方法

《iScience》：A systematic approach to quantitative nanoscale mass spectrometry using atomic force microscopy

　　亮点
- AFM悬臂梁的共振频率已系统地进行校准，用于质量检测
- 局部树脂加载在纳克级别的质量下产生了可测量的共振频率变化
- 实验得到的共振频率变化与COMSOL有限元模拟结果非常吻合
- 该框架使得在纳米尺度上进行定量AFM质量分析成为可能

摘要
原子力显微镜（AFM）通过微悬臂梁的共振频率变化实现质量检测，但定量测量可能受到校准和环境因素的影响。本研究探讨了经过校准的AFM悬臂梁和受控的质量加载是否能够提供纳克级别的质量估计。悬臂梁通过 force-distance 测量进行清洁和校准，并在环境条件下优化了共振采集参数。在悬臂梁上局部沉积紫外线固化树脂以产生质量加载，并使用质量-弹簧模型和有限元模拟来测量和分析共振频率变化。随着树脂质量的增加，共振频率逐渐下降，表明质量加载与悬臂梁共振行为之间存在一致的关系。有限元模拟再现了共振响应，并 unterstützte 实验测量得到的质量估计结果。这些发现为使用常规AFM悬臂梁进行基于共振的质量定量提供了一个校准和建模框架，并为将定量质量分析扩展到微结构和生物组装体提供了基础。

图形摘要

引言
原子力显微镜（AFM）传统上被认为是一种强大的纳米级成像技术，用于表征表面形貌。然而，现代AFM平台还提供了多种定量测量功能，包括力谱学、纳米力学映射、硬度表征、电属性分析和表面相互作用测量。最近的发展进一步使得在纳米尺度上定量评估材料属性成为可能，如杨氏模量、粘附力、粘弹性及界面力学。因此，AFM已从纯粹的成像技术发展成为材料科学、纳米技术和生物研究中的多功能定量表征平台。AFM已成为能够检测极细微质量变化的强大工具，其灵敏度可达纳克（ng）甚至亚纳米范围。这一能力基于其基本工作原理：当额外的质量引入悬臂梁表面时，会监测到其共振频率的变化。即使是非常微量的吸附或附着物质也会改变悬臂梁的有效质量，从而引起可测量的共振频率下降。这使得AFM成为一种异常灵敏的纳米级探测工具，达到传统分析方法无法企及的灵敏度水平。AFM的纳米级传感能力在生物传感、材料科学和生物医学研究等领域开辟了新的研究方向。在生物传感中，AFM悬臂梁可用于无需标记或侵入性程序即可量化分子结合事件、蛋白质聚集和核酸杂交；在材料科学中，纳克级检测允许实时监测沉积过程、薄膜生长和纳米结构组装；在生物医学研究中，AFM能够探测细胞聚集体、球体和微组织内的微小质量差异，使其成为超越单纯成像的纳米级动态质量分析的定量平台。

基于微悬臂梁的共振传感已在生物、环境和材料科学应用中广泛用于超精细质量检测。最近的研究表明，使用二维材料涂层悬臂梁、单片集成生物传感器系统和微机电系统（MEMS）压阻式悬臂梁平台可提高检测灵敏度。然而，由于校准不确定性、环境阻尼以及实验共振分析与计算验证之间的有限整合，定量重现性仍然具有挑战性。本研究建立了一种系统的基于AFM的校准到验证的工作流程，以提高使用商用悬臂梁进行纳米级共振质量估计的定量可靠性。

然而，几个挑战阻碍了纳克级别的检测。依赖标称悬臂梁规格或未经过验证的校准方法可能导致系统性误差。空气中的阻尼、热漂移和激光对准问题可能会掩盖小的频率变化。此外，使实验结果与固有频率和质量加载效应的预测紧密对齐并不简单。解决这些问题需要一种系统的方法，包括仔细的悬臂梁制备、严格的校准、受控的质量加载以及先进的计算建模。本研究通过建立一个综合框架来解决这些挑战，使用AFM悬臂梁实现纳克级别的质量检测。悬臂梁经过精心清洗以消除外来污染，并直接通过 force-distance (FD) 分析进行校准。准确校准悬臂梁的弹簧常数对于将频率变化转换为基于共振的有效质量估计值至关重要。然后，在环境条件下在悬臂梁远端尖端沉积局部树脂滴，以实现可控的有效质量增量。共振频率变化经过量化，并与在COMSOL Multiphysics?（COMSOL, Inc.）中进行的高保真有限元模拟结果进行系统比较，该软件旨在高空间分辨率下捕捉局部扰动。通过这种结合方法，我们得出了共振频率变化与绝对纳克质量变化之间的稳健定量关系。实验结果、理论计算和数值模拟之间的高度一致性证实了该方法的有效性和重复性。通过减轻与校准、环境阻尼和参数优化相关的不确定性，本研究扩展了利用AFM悬臂梁作为定量纳克级质量传感器的潜力。除了基本材料表征外，这种精度还为细胞力学、组织组成和疾病进展提供了开创性的见解。

结果验证
在空气条件下校准AFM共振频率测量
优化测量条件对于获得精确的AFM悬臂梁共振频率至关重要。这需要一个全面的校准和测量过程。该过程从尺寸校准开始，以准确表示纳米和微米级的位移。AFM的水平轴和垂直轴扫描的尺寸校准是使用校准样品进行的（图1A）。校准样品在x轴、y轴和z轴上的尺寸分别为10 × 10 × 0.085 μm3。这使得在二维和三维成像模式下都能准确表示纳米和微米范围的位移。这一步对于在后续频率分析中 minimizing 几何变形非常重要。

图1 在空气环境中优化共振频率测量
全图说明
- (A) AFM地形系统的基本长度尺度（x轴、y轴和z轴）的校准。
- (B 和 C) 力-距离曲线，显示了作用在悬臂梁上的力随尖端-样品距离的变化；(D) 悬臂梁弹簧常数的确定（插图：激光对准接触模式悬臂梁的背面）。
- (E) 通过悬臂梁振荡测量共振频率。
- (F) 显示在AFM系统操作软件中的频率扫描过程；(G) 裸露悬臂梁的共振频率确定。

尽管悬臂梁的弹簧常数由供应商提供，但为了进行精确实验，实验中使用的悬臂梁的弹簧常数是直接测量和验证的。弹簧常数可以从硬表面上尖端-样品距离相关的力分布变化中得出，这对应于FD曲线（图1B）。当尖端接触硬样品表面时，施加的负载会导致悬臂梁弯曲，从而可以从FD曲线的斜率计算出弹簧常数（图1C）。在线性接触范围内使用的轨迹曲线用于提取弹簧常数，因为它提供了更好的稳定性并减少了与粘附相关的滞后效应。在激光与悬臂梁背面良好对齐的最佳条件下，测量了FD曲线。测得的弹簧常数值为0.2 nN/nm，与AFM尖端供应商提供的值完全一致（图1D）。悬臂梁的弹簧常数是在低力加载条件下通过FD测量得到的。共获取了50次独立的FD曲线，并从回撤曲线的线性接触区域计算出弹簧常数。平均弹簧常数为 k = 0.20119 ± 0.007379 nN/nm（n = 10）。为了防止在校准过程中悬臂梁受损，最大施加力保持在5 nN以下。

为了验证探针的完整性，在校准前后进行了共振频率测量和光学检查，未观察到悬臂梁特性的任何可检测变化。共振频率是在非接触模式下从悬臂梁振动中获得的物理参数（图1E）。因此，在非接触振动模式下测量了铝涂层悬臂梁的共振频率。通过系统调整振动模式（包括振幅、相位和步进分辨率），我们提取了悬臂梁的独特共振峰（图1F）。如放大扫描图像所示，悬臂梁的共振频率为13.84 kHz（图1G），这种共振轮廓在空气操作的AFM系统中由于仪器传递函数和环境阻尼而常见。实验确定的频率与悬臂梁供应商提供的标称值13.00 kHz在实验不确定范围内非常接近。

为了获得共振光谱，需要校准AFM系统参数以确保共振准确性。在校准过程中，识别出定义给定扫描范围内频率分辨率的步进次数（num steps）这一关键参数。因此，使用非接触振动探针进行校准，以评估num steps 对共振检测的影响（图2A）。在恒定扫描范围内，num steps 在四个设置下变化：1,000、200、100和50。在高num steps（1,000、200和100）时，共振曲线显示出平滑连续的轮廓（图2B–2D）。因此，在num steps = 100时可以清晰地定义共振频率的最大值（图2E）。然而，当num steps 减少到50时，分辨率不足以唯一确定频率峰值（图2F）。由于频率轮廓达到一个平台而不是一个明显的峰值然后趋于平缓，因此难以确定激光强度最大化的频率值（见图2G中的放大图像）。中间步骤100在分辨率和采集时间之间提供了平衡，从而获得了可靠且可重复的光谱。基于这些结果，选择num steps = 100作为所有后续共振频率测量的优化参数。

图2 AFM系统共振频率校准参数
全图说明
- (A) 在振荡模式下测量悬臂梁共振频率。频率扫描过程的界面，显示可调频率范围和步进次数（num steps）参数。通过逐步减少num steps（从(B) 1,000、(C) 200、(D) 100到(F) 50）获得的共振光谱。
- (E 和 G) 分别为num steps = 100和50的共振峰的放大视图，用于比较分析。

研究悬臂梁共振频率随质量加载的变化
研究了质量加载对悬臂梁共振频率的影响。首先，评估了激光位置对悬臂梁共振行为的影响。如图3A所示，激光位于悬臂梁尖端时测量了共振频率（图3B）。随后将激光重新定位到悬臂梁的中点，并再次测量共振频率（图3C和3D）。结果表明，激光在悬臂梁上的位置对悬臂梁的共振频率或振动特性没有显著影响（图3B和3D）。相比之下，当在悬臂梁的自由端沉积树脂滴时，观察到共振频率明显下降。在这些测量过程中，激光始终位于悬臂梁的中点（图3B和3D）。这些结果表明，悬臂梁的动态行为受到附着质量的强烈影响，且这种质量加载可以通过共振频率变化进行定量检测。

图3 使用树脂涂层调制悬臂梁共振频率
全图说明
- (A 和 B) 在裸露悬臂梁背面自由端对准激光并测量其共振频率。
- (C 和 D) 将激光对准从悬臂梁尖端移动到AFM尖端固定区域后的共振频率值比较。
- (E) 横涂树脂的悬臂梁上的激光对准（插图：树脂沉积在AFM尖端附近）。
- (F) 树脂涂层后观察到的共振频率下降。

为了系统研究共振频率随施加在悬臂梁上的质量变化，将不同大小的树脂滴附着在悬臂梁上。通过改变树脂的数量制备不同大小的滴剂，将其放置在悬臂梁上，并用9 W强度的紫外线照射60秒进行固化。树脂滴的大小逐渐增加，最小的树脂滴的横截面积约为108.13 μm2，随后增加到943.87 μm2、1,094.67 μm2和2,703.17 μm2。当树脂完全固化后，在先前设定的条件下测定了悬臂的共振频率（图4A）。图4显示了树脂颗粒大小与悬臂共振频率变化之间的关系。

尽管精确控制树脂滴的位置具有挑战性，但已经尽一切努力将它们放置在悬臂的尖端。使用光学显微镜确认了树脂滴的附着位置和大小。如图4C–4F所示，树脂滴的大小差异非常明显。附有树脂的样品依次标记为样品#1、#2、#3和#4。

如图4G所示，随着树脂滴大小的增加，悬臂的振动频率降低。对照组的频率为13.84 kHz，而带有最小树脂滴（样品#1）的频率降至12.25 kHz。当树脂滴的大小增加到943.87 μm2（样品#2）时，频率迅速降至8.33 kHz，样品#3和#4的振动频率分别为7.81 kHz和5.20 kHz。由于树脂滴大小的增加直接表明其质量的增加，这一结果表明可以通过质量变化检测到悬臂振动模式的变化。特别是从样品#2和#3可以看出，即使质量差异很小，也能检测到悬臂振动模式的变化。

悬臂与树脂滴之间的相互作用可以用质量-弹簧理论来描述。质量-弹簧系统是一个机械模型，用于解释连接在弹簧上的质量的行为。弹簧遵循胡克定律，施加的力与从其平衡位置的位移成正比。该系统表现出简谐运动，即质量在释放后围绕平衡位置来回振动。

根据质量-弹簧理论，可以使用图4G中检测到的共振频率以及设定为0.2 N/m的悬臂弹簧常数来计算树脂滴的质量。首先，使用裸态下的共振频率（13.84 kHz）计算出悬臂的有效质量，得到大约26.5 ng的值。接下来，计算出样品#1、#2、#3和#4的质量，树脂滴的质量分别为6.87 ng、34.99 ng、40.84 ng和87.89 ng（图4H）。

为了验证从质量-弹簧理论估算的纳米级质量的准确性，使用COMSOL Multiphysics进行了有限元模拟。这些模拟基于实验测得的由于树脂滴加载在悬臂上而产生的共振频率变化。

模拟在以下条件下进行：（1）系统配置为能够在固体力学框架内进行三维特征频率分析。（2）接触模式悬臂的几何参数设置为长度450 × 50 × 2 μm3（图5A）。这与实验中使用的悬臂尺寸相同。在实验前使用光学显微镜验证了AFM悬臂的尺寸。从11个独立选择的悬臂获得的测量结果显示，平均尺寸为长度449.6 ± 1.0 μm、宽度49.7 ± 0.5 μm和厚度2.04 ± 0.04 μm（平均值±标准误差，n = 11）。这些值与制造商的标称规格450 × 50 × 2 μm3一致。（3）悬臂的材料属性被建模为基于硅的固体结构，具有以下材料属性：密度2,329 kg/m3、弹性模量17 × 10? kPa和泊松比0.28。（4）定义边界条件，悬臂的一端固定，另一端作为支撑负载的自由边界。（5）悬臂受到大气压力和重力的影响，分别为?1,013.25 hPa和?9.8 m/s2。（6）首先使用参数建模工具（序列类型：物理控制网格）生成均匀网格，该工具根据用户定义的参数自动生成网格。为了提高精度，在COMSOL软件中自由端的网格密度被增加到极细的元素大小（图5C）。在悬臂弯曲过程中，沿其长度分布的应力大小通过颜色渐变来表示。固定区域（红色）的应力相对较高，而施加力的点（蓝色）的应力较低（图5D）。有意采用点质量近似作为一阶简化，以隔离共振频率上的主要惯性加载效应。模拟的基本共振频率为13.00 kHz，这个值被认为是非常可靠的，因为它与所使用的接触模式悬臂的理论特征频率非常接近（图5E）。这种一致性支持了计算模型的有效性和整个实验方法的有效性。随后使用OriginPro（v.8.5，OriginLab Corp.，美国）将添加的树脂质量与相应的频率变化进行了图形化展示。此外，还基于逻辑模型进行了数据拟合（图5F）。

COMSOL模拟用于验证从质量-弹簧理论估算的纳米级质量的准确性。通过使用COMSOL Multiphysics进行了有限元模拟。这些模拟基于实验测得的由于树脂滴加载在悬臂上而产生的共振频率变化。

为了验证从质量-弹簧理论估算的纳米克级质量的准确性，使用COMSOL Multiphysics进行了有限元模拟。模拟在以下条件下进行：（1）系统配置为能够在固体力学框架内进行三维特征频率分析。（2）接触模式悬臂的几何参数设置为长度450 × 50 × 2 μm3（图5A）。这些尺寸与实验中使用的悬臂相同。在实验之前使用光学显微镜验证了AFM悬臂的尺寸。从11个独立选择的悬臂获得的测量结果显示，平均尺寸为长度449.6 ± 1.0 μm、宽度49.7 ± 0.5 μm和厚度2.04 ± 0.04 μm（平均值±标准误差，n = 11）。这些值与制造商的标称规格450 × 50 × 2 μm3一致。（3）悬臂的材料属性被建模为基于硅的固体结构，具有以下材料属性：密度2,329 kg/m3、弹性模量17 × 10? kPa和泊松比0.28。（4）定义边界条件，悬臂的一端固定，另一端作为支撑负载的自由边界。（5）悬臂受到大气压力和重力的影响，分别为?1,013.25 hPa和?9.8 m/s2。（6）首先使用参数建模工具（序列类型：物理控制网格）生成均匀网格，该工具根据用户定义的参数自动生成网格。为了提高精度，在COMSOL软件中自由端的网格密度被增加到极细的元素大小（图5C）。在悬臂弯曲过程中，沿其长度分布的应力大小通过颜色渐变来表示。固定区域（红色）的应力相对较高，而施加力的点（蓝色）的应力较低（图5D）。有意采用点质量近似作为一阶简化，以隔离共振频率上的主要惯性加载效应。模拟的基本共振频率为13.00 kHz，这个值被认为是非常可靠的，因为它与所使用的接触模式悬臂的理论特征频率非常接近（图5E）。这种一致性支持了计算模型的有效性和整个实验方法的有效性。随后使用OriginPro（v.8.5，OriginLab Corp.，美国）将添加的树脂质量与相应的频率变化进行了图形化展示。并且，还基于逻辑模型进行了数据拟合（图5F）。

拟合曲线与模拟数据非常吻合，卡方值降低到4.65 × 10?3，调整后的R2值为1.00。拟合参数为A1 = 13.07 ± 0.06、A2 = 1.13 ± 0.11、x0 = 48.55 ± 1.27和p = 0.87 ± 0.02。与实验测量数据的拟合结果也非常好，卡方值降低到1.03 × 10?13，调整后的R2值为1.00。拟合参数为A1 = 13.84 ± 3.21 × 10??、A2 = 1.14 ± 1.58 × 10??、x0 = 52.90 ± 1.27 × 10??和p = 1.00 ± 1.21 × 10??。无论是模拟得出的数据（黑色方块）还是实验测量的数据（红色三角形），都符合逻辑模型，观察到随着垂直添加的质量增加，悬臂的共振频率降低的趋势（图5G）。

这项研究表明，AFM不仅可以作为高分辨率成像工具使用，还可以用于进行精确的纳米级质量分析。发现严格校准AFM悬臂对于准确测量微量质量至关重要。首先，彻底验证了悬臂的尺寸和机械属性。这一过程有助于最小化测量过程中由于几何变形或悬臂灵活性造成的潜在误差。具体来说，通过FD曲线测量了悬臂的弹簧常数，这些值与供应商提供的规格一致，证实了实验条件的准确性和设备的稳定性。在之前的基于AFM的定量表征研究中也报告了类似的校准考虑，其中弹簧常数的准确性被认为是影响测量可靠性的主要因素。此外，非接触式振动测量进一步确认了这种方法的有效性。实验获得的共振频率与理论预测非常吻合，且在悬臂基系统的预期误差范围内。差异可能归因于悬臂的结构差异、材料涂层和环境阻尼效应，这些因素可能导致共振行为的微妙变化。同时，在放大的共振频率谱图像中观察到的尖锐共振峰表明，通过优化悬臂条件，有效地消除了外部干扰，如粘性阻尼和对准误差。因此，准确测量AFM悬臂的共振频率需要系统校准和弹簧常数验证。这使得可以使用AFM在纳米级别进行精确的质量测量。

除了共振频率设置外，进一步的研究还确认了采集参数（特别是频率步数）显著影响共振谱的质量和可解释性。较低的步数值导致光谱轮廓更加平滑，表明在采集效率和光谱分辨率之间存在固有的权衡。低于某个阈值时，共振峰变得难以区分，从而影响了基于共振的量化的可靠性。通过将参数优化为100步，提高了测量稳定性，并提供了一个可重复的标准，确保了AFM设置之间的兼容性。这些结果突出了严格校准数据采集参数的必要性。虽然在常规AFM实践中经常被忽视，但这一点对于确保纳米级测量的可重复性和可比性至关重要。

后续实验集中在测量由于纳米级质量变化而引起的AFM悬臂共振的变化。最初，通过用聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂层悬臂来增加质量。正如预期的那样，PDMS涂层悬臂的共振频率显著降低。然而，由于PDMS的高粘度和粘附性，选择性及局部涂层在技术上不可行。这导致了整个悬臂表面的不希望的覆盖，引入了意外的变异性（图S1）。因此，使用树脂滴作为质量加载的替代品。本研究特别选择了树脂滴，因为它们允许使用简单且易于获取的实验工作流程进行可控的局部质量加载，这与传统的AFM系统兼容。这些滴液使我们能够控制它们的大小和附着位置，并在可控条件下系统地分析质量-频率关系。许多研究已经展示了使用具有明确定义的几何形状和材料属性的参考对象（如微球、纳米粒子和悬浮微通道谐振器）进行基于悬臂的质量校准，能够在测量之前或期间独立确定添加的质量。相比之下，本研究有意使用UV固化树脂滴，因为它们提供了一种简单、廉价且实验上可行的方法，可以在传统的AFM悬臂上生成局部质量加载，而无需特殊的微操控或微流控系统。然而，与校准过的颗粒不同，沉积的树脂滴没有预定义的体积或几何形状。尽管可以通过光学方法测量它们的投影横截面积，但它们的三维形态、接触角和聚合引起的形状变化使得仅基于几何测量无法准确确定滴液的体积和质量。因此，添加的质量不是从滴液的尺寸或材料密度估算的，而是通过将实验测量的共振频率变化与使用相同悬臂几何形状和边界条件进行的有限元模拟相关联来间接确定的。实验结果与COMSOL模拟之间的密切一致性支持了这种间接质量确定方法在所研究的纳米克级质量范围内的有效性。

与对照组相比，树脂涂层悬臂的共振频率显著降低，证实了即使是非常小的质量变化也可以通过AFM共振光谱灵敏地检测到。特别是从悬臂耦合的树脂颗粒大小分析中得出的结果非常有趣。较大的树脂颗粒倾向于产生更大的共振预测，证实了谐振子模型在纳米级别上的有效性。重要的是，这些结果不仅仅是概念验证，还表明共振频率的变化与添加的质量在定性和定量上相关。目前的分析假设理想化的点质量位于悬臂的自由端，而实际树脂滴具有有限的尺寸和空间分布的质量分布。因此，分布式的加载可能会改变有效的模态参与，并略微改变与理想化集中质量假设相比的共振频率响应。此外，液滴位置与悬臂梁尖端的微小偏差可能会降低质量敏感度，因为模态位移幅度在远离自由端时会减小。基于共振的悬臂梁质量传感的实际检测限受最小可分辨频率偏移、有效模态质量和环境噪声源的影响。根据实验实现的频率分辨率和有效悬臂梁质量模型，本研究中可检测的质量变化在优化环境条件下估计在纳克（6.87–87.89 ng；见图4H）范围内。基于有限元仿真结果，在大约1–800 ng的附加质量范围内观察到了可测量的共振频率偏移，表明悬臂梁具有检测该范围内纳克级质量变化的潜力。这种灵敏度与之前报道的在空气中工作的微悬臂梁质量传感器一致，这些传感器的检测范围通常从数百皮克到几纳克不等，具体取决于共振稳定性和测量噪声。通过使用树脂颗粒的实验，我们证明了基于原子力显微镜（AFM）的共振分析可以用来测量细胞聚集物或球体的质量，为将这种方法扩展到更复杂的生物系统提供了基础。也许这项研究最显著的方面在于实验测量与共振频率计算模型的整合。模拟结果再现了AFM悬臂梁的几何和材料属性，得出的共振频率与测量和理论计算的结果相匹配。这种一致性清楚地证明了模拟参数的准确性。更重要的是，这种模拟使得使用质量-弹簧系统可以精确计算纳克级质量。能够将共振频率偏移与有效共振等效质量相关联，进一步支持了AFM作为纳米级共振基础质量分析工具的实用性。此外，已建立的质量-频率关系使研究人员能够根据实验结果准确预测未知的质量值。由于实验研究的质量范围仅导致悬臂梁产生轻微的结构变形，因此预计非线性几何效应可以忽略不计。因此，使用线性特征频率分析来评估与质量加载相关的共振频率偏移是合适的近似方法。

本研究强调了基于AFM的共振频率分析可以作为纳米级质量检测的强大方法。通过系统地解决校准、环境稳定性、涂层策略和计算建模等方法学问题，我们建立了一个明确的实验和理论框架，确保了可靠性和可重复性。能够在纳克级别检测和量化微小的质量变化为生物学研究开辟了有趣的应用可能性，尤其是在评估三维细胞球体、肿瘤微组织或其他微装配的物理性质方面。这种方法在材料科学中也可能有用，因为在材料科学中，准确表征纳米结构的质量加载和机械共振变得越来越重要。未来的研究将集中在改进选择性涂层方法以实现更精确的质量控制，并扩展计算框架以包括粘弹性和异质材料属性。最终，将AFM共振光谱与先进的建模技术相结合，将为纳米级质量测量建立一个新的范式，将基础生物物理学与创新的生物医学应用联系起来。目前的结果为使用AFM悬臂梁进行基于共振的纳米级质量传感奠定了基础。虽然这种方法最终可能对生物应用有用，但在直接应用于细胞、组织和肿瘤球体之前，还需要在生物学相关的实验条件下进行进一步研究。

在解释研究结果时，应考虑几个限制。首先，使用了树脂滴作为模型质量加载材料，而不是生物样本或校准的参考颗粒。尽管树脂滴提供了一种实用且可控的局部质量加载方法，但它们不规则的三维形态和变化的接触几何形状使得无法通过几何测量直接确定其质量。因此，通过将实验测量的共振频率偏移与有限元仿真相关联来间接估计附加质量。虽然实验测量与仿真之间的一致性支持了这种方法的有效性，但使用间接的质量确定方法可能会引入不确定性，应使用具有独立确定质量的参考材料进一步评估。其次，当前分析基于一个理想化的集总质量模型，其中假设附加质量集中在悬臂梁尖端附近。实际上，沉积物体的质量是空间分布的，其位置和几何形状可能会影响模态参与度和共振频率偏移。因此，未来包含分布式质量加载和实验确定的沉积位置的研究可能会提高定量精度。第三，估计的检测范围是在优化环境条件下获得的，可能不能直接代表生物学相关环境下的检测性能。流体阻尼、温度波动、表面相互作用和样本附着等因素可能会显著影响共振稳定性和质量敏感度。最后，尽管结果证明了使用AFM共振分析可以检测纳克级质量，但直接用细胞、球体或其他生物样本进行验证超出了本研究的范围。需要使用生物学相关的样本和独立校准的质量标准进行进一步研究，以确定这种方法的准确性、可重复性和生物学质量测量的适用性。

**资源可用性**
更多关于资源和试剂的信息和请求应联系主要联系人Sangwoo Kwon（[e-mail]）。

**材料可用性**
本研究没有生成新的独特试剂或生物资源。所有使用的材料都是商业上可获得的，或在STAR Methods中有描述。

**数据和代码可用性**
• 本研究生成和分析的数据集，包括AFM共振频率测量和质量加载数据，可应合理要求从主要联系人处获取。
• 本研究没有生成原创代码。用于数据分析和有限元仿真的软件在STAR Methods中有描述。
• 重现或重新分析本文报告的结果所需的额外信息，可应合理要求从主要联系人处获取。

**致谢**
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）（授权号RS-2024-00352605）的支持，由韩国政府（MSIT）资助。

**作者贡献**
S.K. 负责撰写草案、方法学、数据管理和概念化。K.S.K. 负责撰写初稿、审阅和编辑以及监督。

**利益声明**
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能影响本文报告的工作。

**STAR★方法**
**关键资源表**
- **试剂或资源**
- **来源标识符**
- **软件和算法**
- COMSOL Multiphysics 5.0 (COMSOL Inc.)
- OriginPro 8.5 (OriginLab Corp.)
- **其他**
- AFM系统 (AFMWorkshop Inc.)
- 光学显微镜 (ZEISS NA806-LQD)
- ContAl-G悬臂梁 (BudgetSensors?)

**预算**
- **ContAl-GPR-T190悬臂梁** (BudgetSensors?)
- **PR-T190** (BudgetSensors?)
- **UV固化树脂** (PastelCraft Inc.)

**方法细节**
**悬臂梁准备**
实验前，AFM悬臂梁（ContAl-G和PR-T190，BudgetSensors?，保加利亚）经过严格的清洁程序，以去除可能影响测量精度的有机残留物或颗粒污染物。清洁程序包括依次浸入分析级丙酮（5分钟）、异丙醇（5分钟）和去离子水（5分钟，共3次），每个步骤都在无菌条件下进行以最小化污染。溶剂处理后，悬臂梁在高纯度氮气流下彻底干燥，并存储在无尘、环境控制的室内以备进一步使用。基线表征是通过在环境环境中使用AFM系统的接触和非接触（敲击）模式测量每个悬臂梁的自然共振频率来进行的（Table Top，AFMWorkshop Inc., USA）。具体来说，通过FD曲线分析定量确定了悬臂梁的弹簧常数。这一步骤用于在树脂沉积前建立基线频率谱。

**共振频率测量**
在空气条件下，使用非接触AFM模式测量悬臂梁的共振频率。悬臂梁通过内置的压电执行器激发，并在包含第一个弯曲共振模式的频率范围内获取共振谱。频率扫描采用0.01 kHz的步长进行，同时保持恒定的激发幅度。共振频率是根据共振谱的最大振幅位置确定的。每次测量重复50次，平均值用于后续分析。所有测量都在相同的环境条件下进行，以最小化由于温度波动和仪器漂移引起的变化。

**通过树脂质量加载调节悬臂梁共振频率**
为了系统地研究悬臂梁共振频率与应用质量之间的相关性，在每个悬臂梁的尖端沉积了不同体积的树脂滴。在光学显微镜下进行树脂沉积，以控制液滴的位置和均匀性。精确调整每个悬臂梁的树脂体积，以建立质量加载条件的梯度。沉积后，通过暴露于9 W紫外线（UV）光1分钟使树脂光固化。固化参数经过优化，以最小化收缩伪影和密度不均匀性。沉积的树脂滴的直径大约在10到70 μm之间，通过光学显微镜确定。在共振测量之前，对代表性液滴几何形状进行了表征，以确保样本间的质量加载条件一致。沉积的树脂滴并不是作为标准化的校准质量制造的，而是作为实验生成的局部质量负载。随后进行频率扫描分析，以记录共振频率的变化。收集了振幅和相位响应曲线，以表征不同加载条件下的悬臂梁动态。这种系统方法使我们能够定量建立质量-频率关系。

**使用COMSOL Multiphysics进行的质量诱导频率偏移的数值模拟**
使用有限元分析（FEA）进行计算建模，以模拟质量变化对悬臂梁共振频率的影响。FEA使用COMSOL Multiphysics（版本5.0.0，COMSOL Inc.，USA）进行。通过选择三维（3D）几何形状和结构力学模块内的固体力学界面建立模型。随后进行特征频率分析，以评估悬臂梁的共振特性。在整个计算域应用了物理控制的网格，并将网格统一设置为“Fine”，对应于最大元素大小约为36 μm和最小元素大小约为4.5 μm。所有模拟的网格元素大小统一设置为Fine（元素质量：0.86，元素数量：约45,000），以保持数值一致性和准确性。悬臂梁被建模为弹性梁，边界条件对应于固定-自由配置。通过在悬臂梁的自由端引入点质量来实施质量加载，模拟树脂沉积或纳米颗粒粘附。分配了一系列离散的点质量值（m1, m2, m3等）来评估共振频率偏移。使用精细的有限元网格以确保数值精度，并对加载区域附近的局部扰动进行了额外的细化。进行自然频率分析以提取基频和更高阶的共振模式。模拟数据与从简化的质量-弹簧模型得出的分析预测进行了比较。

**通过共振频率偏移量化树脂质量**
通过比较沉积前后悬臂梁的共振频率谱来实验量化树脂质量。使用AFM非接触振动模式进行测量，以追踪由粘合树脂引起的频率偏移。每个未加载悬臂梁的共振频率用作基线，并将加载树脂后的悬臂梁频率与该基线进行比较。频率下降转换为等效的质量变化，使用以下关系：
Δm = ?2m_eff × Δf
其中Δf表示频率偏移，m_eff是有效悬臂梁质量，f是基线共振频率，Δm对应于计算出的树脂质量。通过系统地对不同大小的树脂滴应用这种方法，建立了树脂质量和频率响应之间的定量关系。

**定量和统计分析**
在相同的实验条件下重复50次共振频率测量，平均值用于后续分析。这里，n = 50表示重复的共振频率测量次数，不代表独立实验样本的数量。数据以平均值±标准误差（SEM）的形式呈现。使用OriginPro 8.5（OriginLab Corp., USA）通过逻辑模型拟合分析质量与共振频率之间的关系。使用缩减的卡方值和调整后的R平方值评估拟合优度。采用COMSOL Multiphysics 5.0（COMSOL Inc.，美国）进行了有限元特征频率仿真，将仿真得到的共振频率与实验测量值进行了对比。由于本研究旨在表征共振频率响应、量化质量加载与共振频率之间的关系，并将实验测量结果与计算仿真结果进行对比，而非检验不同实验组之间的差异，因此没有进行推断性统计测试。统计和定量分析的详细信息见相应的图例以及结果部分和STAR方法章节（如适用）。补充信息（1）PDF（630.15 KB）文件S1。图S1