《iScience》：Ancient somatosensory circuit architectures employ flexible molecular strategies
编辑推荐：
保守的神经回路架构在多大程度上依赖于共享的分子特化程序，目前仍不清楚。本研究通过分析小鳐（Leucoraja erinacea）——一种保留了有鳍类和肢体类身体构型祖先特征的早期分化脊椎动物——的躯体感觉系统来回答这一问题。研究人员发现，躯体感觉回路组织的核心
保守的神经回路架构在多大程度上依赖于共享的分子特化程序，目前仍不清楚。本研究通过分析小鳐（Leucoraja erinacea）——一种保留了有鳍类和肢体类身体构型祖先特征的早期分化脊椎动物——的躯体感觉系统来回答这一问题。研究人员发现，躯体感觉回路组织的核心特征，包括脊髓的分层组织（laminar organization）以及感觉传入纤维的背侧限制性投射，均被深度保守。出乎意料的是，背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）感觉亚型特化的分子程序与哺乳动物存在广泛差异。尽管DRG神经元亚型特化和脊髓连接依赖于靶组织来源的信号，鳐类却采用了截然不同的神经营养因子受体（neurotrophin receptor）和转录因子（transcription factor, TF）身份编码。这些发现支持一个模型：保守的脊髓回路架构提供了一个稳定支架，在该支架上灵活的神经元特化程序得以运作，从而促成脊椎动物躯体感觉系统的演化多样化。
论文解读
一、研究背景与科学问题
在两侧对称动物中，神经系统在保留祖先模式核心特征的同时，其命运特化和回路组装的机制却发生了广泛多样化。一个核心问题在于：保守的神经回路架构是否依赖于共享的发育程序？回答这一问题需要对系统发育上相距较远的脊椎动物进行比较分析，以区分祖先特征与衍生创新。
脊椎动物躯体感觉系统为研究神经回路演化提供了理想模型。在哺乳动物中，躯体感觉由超过十余种遗传和生理上截然不同的背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）神经元亚型介导，主要分为三大类——机械感受器（mechanoreceptor）、伤害感受器（nociceptor）和本体感受器（proprioceptor）——它们将模态特异性信息传递至脊髓（spinal cord, SC）内空间有序的回路中。在发育过程中，靶组织来源的信号启动程序，赋予感觉神经元模态特异性的分子特征。哺乳动物的三大类躯体感觉神经元分别优先表达三种神经营养因子受体之一：ntrk1（伤害感受器）、ntrk2（机械感受器）和ntrk3（本体感受器）。然而，这种靶依赖型回路组装策略的演化起源尚属未知。
早期分化的脊椎动物谱系为重建躯体感觉回路的祖先组织提供了切入点。软骨鱼类（包括鳐、鲨和魟）代表了一个早期脊椎动物谱系，其初级躯体感觉神经元包被于DRG中。解剖学和功能研究表明，软骨鱼拥有相对简化的躯体感觉系统，表现为DRG胞体大小均匀、轴突直径和刺激反应谱呈双峰分布。值得注意的是，软骨鱼缺乏无髓C纤维——后者在哺乳动物中传递伤害性信号并构成DRG神经元的大多数。此前对水生脊椎动物感觉系统的研究多集中于特化模态（如侧线、电感受器官或Rohon-Beard神经元），而经典躯体感觉的演化历史尚未被探索。鳐类DRG中是否存在分子上截然不同的伤害感受和机械感觉群体、这些神经元在发育过程中如何被特化、以及它们是否参与保守的脊髓疼痛与触觉处理回路，均属未知。这一空白限制了将基础脊椎动物躯体感觉的功能与行为研究同现代遗传模型中的感觉神经元多样性联系起来。
小鳐（Leucoraja erinacea）为研究躯体感觉多样性和回路组织的演化提供了可操作的实验系统。鳐类采用双足样行走式鳍运动行为，其受控于与四足动物共享遗传特征的脊髓神经元。然而，这种运动回路的深度保守是否延伸至躯体感觉系统仍属未知。
二、研究内容与主要结论
研究人员整合分子谱系分析、空间转录组学和胚胎操作，检验保守的回路架构是否依赖于共享的分子特化程序，并探索产生感觉神经元多样性的保守机制。研究发现：脊髓背侧的分层组织是脊椎动物的祖先特征；鳐类DRG感觉神经元采用与哺乳动物截然不同的神经营养因子受体和转录因子身份编码；靶组织来源的信号在感觉神经元特化与中枢连接中发挥保守的耦合作用。这些发现支持一个模型——保守的脊髓回路架构提供稳定支架，其上灵活的神经元特化程序得以运作，从而促成脊椎动物躯体感觉系统的演化多样化。
三、关键技术方法
研究人员采用多层次的分子与空间分析手段。首先，对st31–st32阶段小鳐胚胎进行批量RNA测序（bulk RNA-seq）和单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq），后者采用Particle-templated Instant Partition sequencing（PIPseq）技术直接从冷冻组织捕获细胞核，共获得22,724个细胞核（脊髓15,697个，DRG 6,577个）。其次，利用10× Genomics Xenium空间转录组学平台，设计包含300个基因的定制探针面板，在多个脊髓节段水平解析基因表达的时空分布。此外，研究人员还采用了杂交链式反应（hybridization chain reaction, HCR）荧光原位杂交、免疫组织化学以及单侧鳍芽切除（fin ablation）胚胎操作实验。样本来源为美国伍兹霍尔海洋生物学实验室（Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA）提供的小鳐胚胎。
四、主要研究结果
1. 小鳐躯体感觉神经元多样性的整合分子与空间分析
研究人员通过免疫染色发现，ISL1在鳍形成（st28）至鳍可动（st32）阶段之间表达于DRG神经元，而RUNX3表达于st29首次出现，且在st32前约占DRG神经元的45%–70%。snRNA-seq和Xenium空间转录组学分析确定了脊髓和DRG中各自富集的基因，包括脊髓抑制性神经递质相关基因（gad1、gabrg2）和DRG感觉模态相关基因（piezo2、trp通道）。转录因子分析鉴定了脊髓祖细胞命运调控因子（olig2、nkx6.1、irx3）、有丝分裂后脊髓神经元标志物（foxp2、lbx1、lhx5）以及DRG感觉神经元标志物（etv4、isl2、runx3）。
2. 小鳐背侧脊髓分层组织的深度保守
对脊髓细胞核的重新聚类鉴定出29个细胞簇，其中许多与哺乳动物亚型具有一致的分子特征。空间转录组学揭示了背侧脊髓的层状组织：浅层背角神经元表达lmx1a、lmx1b和tlx3b——哺乳动物中接受伤害性输入的dI5神经元标志物；更腹侧的神经元表达lhx2、lhx9和barhl2——接受机械感觉输入的dI1神经元标志物。通过VGLUT1抗体标记DRG中枢投射，研究人员发现VGLUT1?传入纤维终末富集于背侧脊髓，并在st32时延伸至更腹侧的LHX2? dI1样群体，但不进入腹侧深层。这表明脊髓分层组织和背侧限制性感觉输入是脊椎动物躯体感觉系统的深度保守特征。
3. 鳐类感觉神经元身份的分化神经营养因子受体编码
出乎意料的是，鳐类中runx3?/ntrk3?神经元——在哺乳动物中标记支配肌肉的本体感受性感觉神经元——共表达哺乳动物中与伤害感受身份相关的标志物，包括trp通道（如trpa1）和tac1。HCR和Xenium分析进一步显示，大多数ntrk3?神经元共表达ntrk1，而ntrk2a与ntrk3基本互斥。表达机械感受器通道piezo2的DRG神经元表达ntrk2a，与ntrk2作为机械感觉DRG神经元保守标志物一致。trpv1和trpc4在ntrk1/3?细胞中检测到，trpa1在较小亚群中表达，tac1也在ntrk1/3?细胞中检测到。这些结果证明鳐类感觉神经元身份由分化的神经营养因子受体编码定义，分子特征在单个神经元内以不同于哺乳动物的方式组合。
4. 转录因子表达界定DRG感觉神经元亚型
研究人员鉴定了DRG中富集的32个转录因子，分为四类表达模式：广泛表达型（mllt11b、tlx3b、pou4f3、six1）；ntrk1/3?富集型（runx3、skor2、ebf3a、casz1）；ntrk2?富集型（tbx2b、onecut2、etv4）；以及重叠表达型（shox2、phf24、runx1）。其中etv4和onecut2标记ntrk2a?群体中互不重叠的亚群，提示ntrk2a?/piezo2?群体内存在不同的机械感觉样亚型。此外，九个转录因子（bcl11ba、drgx、maf、hey、pou4f2、pou4f3、shox2、skor2、tlx3b）同时表达于DRG和背侧脊髓神经元，提示共享转录程序可能参与连接神经元群体之间的布线特异性。
5. 靶组织来源信号在感觉和运动神经元发育中的祖先作用
单侧鳍芽切除实验显示，st31时胸鳍和盆鳍运动神经元损失65%–70%和30%–40%（以FOXP1?神经元计），而ISL1?FOXP1?神经元（主要为轴肌支配运动神经元亚型）不受影响。DRG神经元在st31时数量基本不受影响，但至st32时切除侧DRG神经元数量显著减少，其中吻侧胸鳍节段减少超过70%。这些结果表明靶组织来源信号对运动神经元和感觉神经元的维持均至关重要。
6. 保守的SMAD磷酸化标记DRG对靶组织来源信号的早期反应
研究人员在鸡胚和小鳐中均检测到pSMAD（磷酸化SMAD1/5/8）标记。鸡胚中pSMAD标记约30%的ISL1?感觉神经元，小鳐中pSMAD标记最早在st30出现，且富集于RUNX3?神经元——即ntrk2a?机械感觉样亚型。单侧肢芽/鳍芽切除后，鸡胚中SMAD磷酸化水平降低约70%，小鳐中降低约53%。这证明SMAD磷酸化是感觉神经元响应肢体/鳍来源信号的保守早期标志物。
7. 靶组织来源信号耦合脊椎动物感觉神经元身份与中枢连接
鳍芽切除后，ntrk2a和ntrk1的内外侧分离模式在st31仍保持正常，表明早期神经营养因子受体模式 largely 不依赖靶组织。然而，受肢体来源信号调控的基因etv4和ret表达显著减少，而runx3表达扩展至整个DRG，RUNX3?ISL1/2?神经元比例从53%增加至82%。在脊髓中，鳍芽切除后VGLUT1?感觉终末主要局限于背侧最浅层，向深层延伸的投射显著减少，所有层域的VGLUT1信号均降低，以深层区域减少最为显著。这些结果表明靶组织来源信号同时调控感觉神经元的分子特化和背侧感觉传入靶向的保真度。
五、讨论与结论
研究人员发现，鳐类脊髓和DRG神经元均表现出分子多样性，脊髓背侧存在由命运决定因子表达定义的分层组织。DRG神经元可分为机械感觉样（ntrk2a?/piezo2?）和伤害感受样（ntrk1/3?、trp?、tac1?）两大类，并通过转录因子组合表达实现进一步多样化。然而，鳐类中runx3与ntrk1和ntrk3共表达的组合在哺乳动物中与伤害感受器特化不相容，表明感觉神经元命运决定因子的部署经历了显著演化分化。鳍芽切除实验表明，逐步解析分子身份是感觉神经元特化的祖先机制：切除鳍芽后，鳐类DRG神经元未能将runx3限制于ntrk1/3?群体，未激活etv4和ret等关键发育基因，并伴随中枢连接缺陷。SMAD磷酸化被鉴定为DRG神经元响应靶组织来源信号的早期保守标志物。ntrk2?和ntrk1/3?群体的初始分离不依赖靶组织，支持DRG神经发生的祖先双相模型——广泛感觉类别在靶组织支配前获得核心分子身份，随后由靶组织来源信号介导精修和回路整合。鳐类DRG神经元表达多种trp通道和tac1、calca等经典哺乳动物伤害感受标志物，其推定伤害感受器类似于哺乳动物薄髓Aδ纤维。研究人员推测肌肉本体感受可能是较晚的演化创新，可能伴随陆地运动出现；鱼类可能利用替代的机械感觉反馈系统调节运动输出。总之，保守的脊髓回路架构和靶依赖成熟程序在脊椎动物中维持躯体感觉组织，而感觉反馈的分子策略——包括受体使用和命运决定因子部署——保持演化灵活性。回路架构与分子特化的解耦为脊椎动物感觉运动系统在保持功能组织的同时容纳演化创新提供了通用机制。
