高分辨率熔解分析结合多重PCR鉴定单一及混合硅藻物种的实验研究

《iScience》：An experimental study on HRM combined with multiplex PCR for the identification of single and mixed diatom species

亮点

• 通过八种海洋硅藻鉴定和验证了15对特异性引物

• 使用两对引物进行HRM分析可快速鉴定单一硅藻物种

• 传统HRM对混合硅藻样本分辨率低，产生融合峰

• 多重PCR-HRM部分提高了混合硅藻物种的鉴别能力

摘要

硅藻是生态环境和法医科学的研究对象。混合硅藻样本的鉴定始终是一个难题。多重聚合酶链式反应-高分辨率熔解（PCR-HRM）提供了一种潜在解决方案，但该方法在分析单一和混合硅藻样本中的有效性尚不清楚。本研究聚焦于八种海洋硅藻，鉴定并设计相应的引物，初步探索HRM技术结合多重PCR用于海洋硅藻物种鉴定的方法。通过两对引物组合，我们实现了单一硅藻的快速鉴定。实验发现，HRM技术对混合硅藻样本的鉴定能力下降，而多重PCR-HRM技术可提高混合硅藻样本的鉴定准确性。使用三种引物的混合物，我们在混合样本中鉴定出四种硅藻物种。该方法可改善混合硅藻样本的鉴定能力，并为硅藻物种鉴定提供新途径。

图形摘要

引言

硅藻是一类水生单细胞植物，物种众多，广泛分布于河流和海洋等各种自然水体中。海洋硅藻在海洋生态系统中扮演着关键角色。它们不仅是许多海洋生物的食物来源，还通过光合作用吸收二氧化碳，并将其中的碳封存在生物质中。它们在碳循环和生物地球化学循环中发挥着关键作用。同时，硅藻的物种和数量也能反映海洋生态系统的健康状况。此外，硅藻在法医科学中也具有重要研究价值。在溺水过程中，硅藻通过呼吸进入肺部，随后经血液循环扩散至全身。在肝脏和肾脏等组织和器官中检测到硅藻，有力支持了溺水的诊断。此外，鉴定硅藻物种还可协助法医推断溺水地点。

目前，传统的硅藻检测方法主要依赖于在光学显微镜或电子显微镜下的观察和分类。这些方法耗时费力，需要具有丰富专业知识和经验的硅藻分类学家，而这类专家非常稀少。人工鉴定容易受到操作者主观判断的影响，从而降低了硅藻分类的准确性。分子生物学的最新进展为硅藻检测提供了新方法。该方法利用遗传标记鉴定特定物种。与形态学方法相比，基于脱氧核糖核酸（DNA）序列的硅藻检测方法操作更简单方便，在硅藻检测中表现出更高的敏感性。因此，该方法在硅藻检测中被广泛研究和应用。然而，硅藻研究和实践中涉及的样本通常是各种硅藻的混合物，如何实现混合硅藻样本的分子检测一直是分子物种鉴定中的挑战。最近开发的多重聚合酶链式反应-高分辨率熔解（PCR-HRM）为此问题提供了潜在解决方案。然而，该技术能否应用于混合硅藻样本的检测及其检测能力尚未见报道。

HRM技术是一种新兴的遗传分析技术。其原理基于双链DNA与饱和荧光染料的结合。在加热过程中，双链DNA逐渐解离为单链分子，解离过程中荧光染料被释放。通过实时监测荧光信号的变化，可获得特征性熔解曲线。HRM技术操作简单，聚合酶链式反应（PCR）扩增后可直接进行熔解反应，有效降低了交叉污染的风险。此外，HRM技术具有高通量、成本低和应用广泛的特点。目前，HRM技术已广泛用于细菌和病毒等微生物的物种鉴定，但在硅藻检测研究中的应用报道很少。HRM技术理论上能够检测单管中的所有扩增产物。然而，我们的初步实验发现，使用单一引物扩增多个物种DNA时，熔解曲线只能形成一个或两个特征峰。这可能是由于扩增产物的解链温度差异较小，导致峰融合，难以有效区分物种。多重PCR（mPCR）技术可在单一PCR扩增反应中同时加入多对特异性引物，靶向同一DNA模板的不同区域，从而扩增多个目标DNA片段。我们可以利用mPCR扩增的多个目标DNA片段，并通过HRM技术进行分析。利用扩增产物解链温度的差异，可实现物种鉴定。

多重PCR-HRM结合了PCR技术和HRM曲线分析，可同时检测和区分样本中的多种DNA序列变异。这使得我们可在单一反应中分析多个目标基因区域，从而实现物种鉴定。这通常需要设计多对引物，以确保不同目标片段具有不同的长度或GC（鸟嘌呤和胞嘧啶）含量，从而产生可区分的熔解曲线。因此，本研究探索HRM技术与mPCR技术的结合，以考察其在混合硅藻样本检测中的价值和能力。

结果

实验硅藻物种的鉴定和分类

扫描电镜（SEM）检查证实，八种培养硅藻物种表现出与其购买分类单元一致的形态特征（图1）。

图1 八种纯硅藻物种的SEM检查结果

Navicula sp.（A）、Odontella sp.（B）、Nitzschia sp.（C）、Chaetoceros sp.（D）、Ditylum sp.（E）、Skeletonema sp.（F）、Cylindrotheca sp.（G）和Asterionellopsis sp.（H）。比例尺：5 μm（C和D）、8 μm（A）、10 μm（F–H）、15 μm（B）和30 μm（E），如图所示。

引物设计和筛选结果

通过文献筛选，我们共获得18对引物，通过自行设计获得65对引物。经过实验筛选，15对引物符合标准，包括8对来自文献的引物和7对自行设计的引物（表1）。通过重复实验，这些引物成功鉴定了实验硅藻的1至8个物种。

表1 硅藻特异性引物信息

| 引物 | 引物序列 | 目标基因 | 退火温度（°C） | 扩增子长度（bp） | 来源 |
|---|---|---|---|---|---|
| UPA99-F | GGAAACGTACAAAGGTTTCC | UPA599 | 59 | 99 | Liu et al. |
| UPA99-R | GTCGCTGCACGACTTGTAGG | | | | |
| 18S-V7F | TCCGTTAACGAACGAGACC | 18S | 58 | 130 | Zhao et al. |
| 18S-V7R | GGCCATCACAGACCTGTTATTG | | | | |
| PsaA-2-F | GGCACTGGATCTACACGGTA | PsaA | 61 | 146 | Vinayak et al. |
| PsaA-2-R | TCCGTATCACACCACAACCA | | | | |
| rbcL197-F | CTCAACCATTCATGCC | rbcL | 47 | 197 | Quyi Xu |
| rbcL197-R | CTGTGTAACCCATAAC | | | | |
| DiatrbcL708F | AGGTGAAGTTAAAGGTTCWTAYTTAAA | rbcL | 55 | 312 | Kezlya et al. |
| R3_1 | CCTTCTAATTTACCWACWACTG | | | | |
| Primer1-F | CAATTGGAGGGCAAGTCTGG | 18S | 58 | 236 | Li et al. |
| Primer1-R | CCTGCACGACAACCTAATGN | | | | |
| ND-F | ATTAGGTTTATCTGGTAAAAACTAC | 18S | 53 | 113 | Yu et al. |
| ND-R | TTCTCTCCAACGCATGAA | | | | |
| DNGT-F | CCGTTCTTGACTGGAATCG | TLSU602 | 54 | | Yanjie Sun |
| DNGT-R | AAACCACAAGGGGCTTAGGA | | | | |
| 18S-333NF | GTGGCATTCAGTTGTCGTG | 18S | 58 | 333 | 自行设计 |
| 18S-333NR | CCCTTGTCGGCATAGTTTA | | | | |
| 18S-341JF | CGTTCTGGCATTAGGTTGT | 18S | 55 | 341 | |
| 18S-341JR | ATCCTGAGTCGGCATAGT | | | | |
| rbcL-256ZF | CATCGTGCTGGTAACTCT | rbcL | 60 | 256 | 自行设计 |
| rbcL-256ZR | ACGCAACAGGCATACATT | | | | |
| 18S-196OF | CGGAGGTGCTTTGGTGAT | 18S | 60 | 196 | |
| 18S-196OR | CTGCCTTCCTTGGATGTG | | | | |
| rbcL-NF | AAACATTCCAAGGTCCAG | rbcL | 55 | 419 | |
| rbcL-NR | TTCACGAGCCCATAAAG | | | | |
| 18S-356HF | GGGATACCCATCGTTTACT | 18S | 58 | 356 | |
| 18S-356HR | GATTTCTCATACGGTGCTG | | | | |
| 28S-191CF | ACGGACCAAGGAGTCTAAC | 28S | 58 | 191 | |
| 28S-191CR | CTGGCTTCACCCTATTCA | | | | |

单一硅藻的单一引物HRM曲线可区分硅藻物种

使用单一引物对对单一硅藻进行PCR扩增后，进行HRM分析，实验结果如图2所示。以下所有熔解曲线图均为HRM分析获得的导数熔解曲线。使用HRM分析时，每个扩增产物形成一个独特的特征峰。特征峰最高点对应的横坐标代表解链温度。不同扩增产物在各自位置产生形状不同的特征峰，可基于此特征鉴定不同的硅藻物种。引物UPA99、18S-V7、PsaA-2、rbcL197、DiatrbcL708、Primer1、ND、28S-191C和18S-333N均可特异性扩增八种海洋硅藻，每种引物在HRM分析后均产生八条不同的熔解曲线。引物18S-356H和18S-341J可特异性扩增七种海洋硅藻，HRM分析后产生七条不同的熔解曲线。引物rbcL-256Z可特异性扩增四种海洋硅藻，HRM分析后产生四条不同的熔解曲线。引物18S-196O和rbcL-N仅能特异性扩增两种海洋硅藻，HRM分析后仅获得两条不同的熔解曲线。DNGT引物可特异性扩增Skeletonema sp.。所有阴性对照组均未观察到检测峰。这些结果表明，HRM技术可以区分不同的硅藻物种，不同引物扩增的硅藻数量不同，获得的解链温度也不同（表2）。

图2 不同引物为硅藻产生特异性HRM曲线

（A）引物UPA99可特异性扩增8种海洋硅藻。（B）引物18S-V7可特异性扩增8种海洋硅藻。（C）引物PsaA-2可特异性扩增8种海洋硅藻。（D）引物rbcL197可特异性扩增8种海洋硅藻。（E）引物DiatrbcL708可特异性扩增8种海洋硅藻。（F）引物Primer1可特异性扩增8种海洋硅藻。（G）引物ND可特异性扩增8种海洋硅藻。（H）引物28S-191C可特异性扩增8种海洋硅藻。（I）引物18S-333N可特异性扩增8种海洋硅藻。（J）引物18S-356H可特异性扩增7种海洋硅藻。（K）引物18S-341J可特异性扩增7种海洋硅藻。（L）引物rbcL-256Z可特异性扩增4种海洋硅藻。（M）引物18S-196O仅能特异性扩增2种海洋硅藻。（N）引物rbcL-N仅能特异性扩增2种海洋硅藻。（O）引物DNGT仅能特异性扩增Skeletonema sp.。

展示了3次独立实验（n = 3）的代表性结果。另见图S1和S2。

表2 不同引物扩增的不同硅藻的解链温度（°C）

"–"表示该引物不扩增对应的藻类物种。

| 引物 | Navicula sp. | Odontella sp. | Skeletonema sp. | Chaetoceros sp. | Nitzschia sp. | Ditylum sp. | Cylindrotheca sp. | Asterionellopsis sp. |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| UPA99 | 79.25 | 78.73 | 79.40 | 79.28 | 79.35 | 79.72 | 79.28 | 79.35 |
| 18S-V7 | 80.27 | 81.37 | 81.85 | 80.10 | 80.85 | 82.77 | 79.32 | 80.50 |
| PsaA-2 | 80.88 | 81.05 | 81.28 | 81.75 | 80.90 | 81.42 | 81.65 | 81.52 |
| rbcL197 | 79.00 | 79.45 | 79.13 | 79.08 | 78.75 | 78.93 | 77.75 | 79.25 |
| DiatrbcL708 | 79.08 | 79.72 | 79.57 | 78.85 | 78.90 | 79.65 | 78.45 | 80.00 |
| Primer1 | 83.55 | 84.80 | 82.58 | 84.62 | 84.32 | 84.03 | 84.60 | 83.80 |
| ND | 75.75 | 75.23 | 75.20 | 76.28 | 75.15 | 75.28 | 75.03 | 75.65 |
| DNGT | – | – | 80.28 | – | – | – | – | – |
| 18S-333N | 79.57 | 80.62 | 78.60 | 80.10 | 79.85 | 79.85 | 79.48 | 79.87 |
| 18S-341J | 79.67 | 79.53 | 78.37 | 79.52 | 79.70 | 79.53 | – | 79.15 |
| rbcL-256Z | 77.25 | – | – | 77.90 | – | 78.53 | 77.87 | – |
| rbcL-N | 78.90 | – | – | – | – | – | 78.43 | – |
| 18S-356H | 80.18 | 80.30 | 78.75 | 79.68 | 79.45 | – | 78.95 | 79.90 |
| 28S-191C | 84.63 | 84.08 | 82.70 | 82.70 | 83.75 | 83.42 | 83.78 | 84.80 |
| 18S-196O | – | 82.97 | 82.03 | – | – | – | – | – |

HRM分析难以区分单一引物扩增的成对硅藻混合物

我们使用引物DiatrbcL708和28S-191C对混合硅藻样本进行HRM分析，其中混合样本由硅藻的成对组合组成。图3A的结果显示，除Navicula sp.与Asterionellopsis sp.的混合物外（后者表现出Navicula sp.的特征峰），与其他六种硅藻物种的成对混合物仅显示各自其他硅藻的特征峰，未与Navicula sp.形成双峰。如图4A所示，当Navicula sp.与Chaetoceros sp.、Nitzschia sp.或Cylindrotheca sp.混合时，可形成双峰，而其余情况显示Navicula sp.的特征峰。如图3B–3G和图4B–4G所示，可观察到2至3个双峰的形成，而其余保持单峰。图3H的结果显示，当其他七种硅藻与Asterionellopsis sp.混合时，仅显示其他硅藻的特征峰，未与Asterionellopsis sp.形成双峰。如图4H所示，除与Skeletonema sp.形成双峰外，Asterionellopsis sp.与其余六种硅藻物种混合时显示其特征峰。从这些结果可以看出，这八种硅藻在不同混合物中表现出抑制或特征峰融合现象，尤其是Asterionellopsis sp.在混合系统中极易受到抑制。

图3 使用引物DiatrbcL708进行HRM分析

Navicula sp.（A）、Odontella sp.（B）、Skeletonema sp.（C）、Chaetoceros sp.（D）、Nitzschia sp.（E）、Ditylum sp.（F）、Cylindrotheca sp.（G）和Asterionellopsis sp.（H）分别与除自身外的其他七种硅藻物种混合后获得的熔解曲线。展示了3次独立实验（n = 3）的代表性结果。另见图S3。

图4 使用引物28S-191C进行HRM分析

Navicula sp.（A）、Odontella sp.（B）、Skeletonema sp.（C）、Chaetoceros sp.（D）、Nitzschia sp.（E）、Ditylum sp.（F）、Cylindrotheca sp.（G）和Asterionellopsis sp.（H）分别与除自身外的其他七种硅藻物种混合后获得的熔解曲线。展示了3次独立实验（n = 3）的代表性结果。另见图S4。

八种硅藻混合物的单一引物HRM无法准确鉴定所有物种

使用引物DiatrbcL708和28S-191C对八种硅藻物种的混合样本进行PCR扩增，然后进行HRM分析。结果显示，两种引物扩增混合硅藻样本均仅形成双峰，无法准确鉴定混合样本中八种硅藻的物种（图5）。

同样地，混合样品形成的双峰无法准确对应其所代表的硅藻物种。这表明，使用单一引物对混合硅藻进行HRM分析时，检测能力下降，无法准确鉴定这八种硅藻的物种。
图5：分别使用引物DiatrbcL708和28S-191C对八种混合硅藻物种进行HRM分析（图片查看器）
(A) 使用引物DiatrbcL708扩增八种混合硅藻样品的熔解曲线。(B) 使用引物28S-191C扩增八种混合硅藻样品的熔解曲线。标注为"混合硅藻"的曲线代表混合样品，其余为阳性对照。展示了3次独立实验（n = 3）的代表性结果。另见图S5。
多引物混合结合HRM技术实现硅藻物种的快速鉴定
我们使用退火温度相近的28S-191C和PsaA-2两种引物混合物，在同一反应管中扩增单株硅藻。结果表明，该两引物混合物在扩增硅藻时能够形成特征性的双峰（图6）。每个峰对应于同一硅藻分别由相应引物扩增所形成的特征峰，未出现扩增抑制或特征峰融合现象。这表明可混合多种引物以实现单株硅藻物种的快速鉴定。我们还采用其他引物组合对单株硅藻进行了多重PCR-HRM分析（图7）。从这些实验结果可以看出，使用两种引物的混合物能够快速、准确地鉴定硅藻物种。
图6：使用混合引物28S-191C和PsaA-2快速鉴定八种硅藻物种（图片查看器）
菱形藻属（Navicula）sp.（A）、齿缝藻属（Odontella）sp.（B）、Skeletonema sp.（C）、 Chaetoceros sp.（D）、舟形藻属（Nitzschia）sp.（E）、Ditylum sp.（F）、Cylindrotheca sp.（G）和Asterionellopsis sp.（H）。展示了3次独立实验（n = 3）的代表性结果。另见图S6。
图7：使用不同引物组合鉴定单株硅藻物种（图片查看器）
(A和B) 分别使用引物PsaA-2和18S-333N混合扩增Nitzschia sp.和Navicula sp.所得的熔解曲线。(C和D) 分别使用引物PsaA-2和Primer1混合扩增Navicula sp.和Ditylum sp.所得的熔解曲线。展示了3次独立实验（n = 3）的代表性结果。另见图S7。
多引物对结合HRM技术鉴定混合硅藻物种
由于单一引物对混合硅藻样品的判别能力下降，无法准确鉴定混合硅藻样品中的硅藻物种。因此，我们采用多种引物对来鉴定硅藻物种。通过研究，我们发现使用18S-196O、rbcL-N和DNGT引物的组合可以区分混合样品中的四种硅藻物种。结果表明，多重PCR-HRM反应体系可以区分四种硅藻：Odontella sp.、Navicula sp.、Cylindrotheca sp.和Skeletonema sp.。四种硅藻混合样品与八种硅藻混合样品扩增后所形成的熔解曲线的形状和位置几乎相同，且单一样品与混合样品所形成的特征峰位置接近（图8）。因此，该扩增体系可以区分Odontella sp.、Navicula sp.、Cylindrotheca sp.和Skeletonema sp.，并同时证明混合样品中存在这四种硅藻物种。据此，我们初步建立了一个用于鉴定混合硅藻样品的多重PCR-HRM体系。
图8：多重PCR-HRM扩增产物的熔解曲线分析（图片查看器）
分别使用引物18S-196O、rbcL-N和DNGT扩增Odontella sp.、Navicula sp.、Skeletonema sp.、Cylindrotheca sp.、这四种硅藻的混合物以及八种硅藻的混合物。展示了3次独立实验（n = 3）的代表性结果。另见图S8。
讨论
本研究以八株纯培养硅藻为研究对象。从内部设计或文献选用的83对引物中，通过实验验证出15对可用于硅藻检测的引物。使用单一引物对扩增单株硅藻样品后进行HRM分析，能够快速鉴定硅藻物种。这证明了HRM技术在单个硅藻物种检测中的应用价值。本研究通过不同引物对扩增所得不同硅藻的熔解温度，为相关研究建立海水硅藻物种鉴定的HRM技术体系提供了实验数据参考。
然而，在自然水环境中常会遇到混合硅藻样品。在混合物种样品的分子物种鉴定技术中，高通量测序技术目前是一种更为有效的途径，它能够同时获得大量物种的DNA序列数据，显著提高物种鉴定的效率。在处理复杂、混合或未知样品时，该技术有潜力揭示其中所包含的物种信息，甚至发现未知物种。尽管高通量测序技术具有上述优势，但其应用受到成本高、实验周期长以及数据分析工作量大且复杂等因素的限制。此外，该技术还高度依赖参考数据库的完整性和可靠性。这些因素共同限制了该技术的广泛应用。虽然多重PCR-HRM技术无法替代高通量测序技术，但它在混合物种鉴定方面也具有一定优势。多重PCR-HRM技术在同一个封闭管中即可完成PCR扩增和HRM检测过程，无需任何中间操作，这不仅降低了交叉污染的风险，还简化了流程并节省了时间。该技术仅需一台高分辨实时荧光PCR仪器和相应试剂，成本相对较低。
在对两两混合硅藻样品及八种硅藻混合物进行分析时，我们观察到硅藻之间的扩增过程中出现相互抑制或相似特征峰融合的现象。这表明单一引物对对混合硅藻样品的物种鉴定能力下降，无法准确判定此类样品中的硅藻物种组成。因此，我们尝试将HRM技术与多重PCR技术（mPCR）结合，用于鉴定混合样品中的硅藻物种。通过组合不同引物，我们初步构建了一个用于鉴定混合硅藻样品的多重PCR-HRM体系。
在构建多重PCR-HRM体系时，引物的设计和选择是关键步骤，直接决定成败。引物的退火温度不应相差过大，但所扩增产物的熔解温度也不能过于接近；若熔解温度相近，则会形成融合峰，无法区分物种。研究表明，在HRM分析中，当扩增产物过长（400–1000 bp）时，其灵敏度和特异性会略有下降（分别下降3.9%和0.6%）。本实验中最常见的问题是引物之间的互补性导致引物二聚体过多。不过在HRM分析过程中，可以直观地观察到引物二聚体的存在，无需使用琼脂糖凝胶电泳进行观察。
多重PCR-HRM体系的扩增结果还受到其他一些因素的影响，例如引物的比例、dNTPs浓度以及Mg2?浓度。研究表明，引物浓度过高会导致引物之间竞争PCR所需材料，从而造成不同位点的扩增失衡，导致实验失败。dNTPs是PCR中合成DNA链的原料，当dNTPs浓度不足时，扩增产物产量降低。在多重PCR中，部分引物可能因原料不足而无法扩增。Mg2?是DNA聚合酶发挥功能所必需的辅因子，Mg2?浓度不足会影响聚合酶活性，从而降低PCR扩增效率。尽管Mg2?浓度过高会增加引物与模板之间的稳定性，但也会增加非特异性扩增。
当我们使用单一引物对八种不同硅藻进行HRM分析时发现，使用同一引物扩增不同硅藻所得的扩增产物熔解温度有时相同或相差不足0.1°C。例如，使用引物UPA99扩增的Chaetoceros sp.和Cylindrotheca sp.的熔解温度均为79.28°C。这可能是由于两种扩增序列相似，也可能是由孔间温差波动导致熔解温度相同所致。因此，我们通过将两种引物混合在同一反应管中扩增硅藻来解决这一问题。若两种引物的组合仍无法鉴定物种，则可使用三种引物的组合，但使用的引物越多，实验越难以进行。
研究的局限性
本研究构建的反应体系目前仅能检测到八种混合样品中的四种硅藻。这可能与特异性引物数量不足以及这些引物之间扩增效率的差异有关。因此，我们将继续针对不同硅藻设计不同的引物，以构建能够检测更多硅藻的多重PCR-HRM体系。同时，我们将通过调整PCR反应体系、验证每个引物的灵敏度以及调整引物之间的浓度比例，对该多重PCR-HRM体系进行优化。本研究未使用环境水样对该体系进行验证。因此，该方法在未知水样中的表现仍不明确。未来，我们将对环境水样进行测试，以评估其在环境检测和法医实践中的实际应用价值。尽管如此，本研究初步证明了多重PCR-HRM体系分析混合硅藻样品的可行性。此外，该方法能够实现硅藻的快速检测，具有特异性高、成本低、操作简便等优点，可在基础实验室中实施，具有广阔的应用前景。
资源可获得性
主要联系人
关于进一步信息、资源和数据的请求应提交给主要联系人周云超（[e-mail]），并由其予以满足。
材料可获得性
本研究未产生新的独特试剂。
数据和代码可获得性
- 本文报告的所有数据将根据请求由主要联系人分享。
- 本文未报告原始代码。
- 重新分析本文所报告数据所需的任何其他信息均可根据请求从主要联系人处获取。
致谢
本研究由国家自然科学基金（批准号82060341和81560304）、海南省院士创新平台科研项目（批准号YSPTZX202134）以及海南省研究生创新项目（批准号Qhys2023-474）资助。
作者贡献
Y.Z.、B.C.、J.C.和J.D.提出研究构思并设计研究方法。Y.Z.和Y.L.参与台架实验和数据收集。Y.Z.和Y.L.进行数据分析和可视化。Y.Z.、B.C.、J.C.和J.D.对项目提供指导监督。Y.Z.和J.D.起草论文。Y.Z.、B.C.、J.C.和J.D.审阅并编辑了论文。
利益声明
作者声明无利益冲突。
论文撰写过程中生成式AI及AI辅助技术的使用声明
在撰写本手稿期间，作者使用了由杭州深度求索人工智能有限公司开发的DeepSeek，对论文的部分内容进行了语言翻译。

在使用该工具后，作者审查并修改了必要的内容，并对已发布作品的内容承担全部责任。

STAR★方法
关键资源表

试剂或资源 | 来源 | 标识符
---|---|---
**化学品、肽和重组蛋白**
Eva Green 荧光染料 | Biotium | 31000
**关键商业检测试剂盒**
Pfu PCR 混合物 | 天根生物科技股份有限公司 | 1109499
富集海水培养基"f/2" | 中国科学院海洋研究所海藻培养保藏中心 | N/A
Erdschreiber 培养基 | 水生生物研究所淡水藻类培养保藏中心 | N/A
**实验模型：生物体/菌株**
Nitzschia sp. | 中国科学院海洋研究所海藻培养保藏中心 | MASCC-0037
Odontella sp. | 中国科学院海洋研究所海藻培养保藏中心 | MASCC-0019
Chaetoceros sp. | 中国科学院海洋研究所海藻培养保藏中心 | MASCC-0031
Navicula sp. | 中国科学院海洋研究所海藻培养保藏中心 | MASCC-0035
Skeletonema sp. | 中国科学院海洋研究所海藻培养保藏中心 | MASCC-0022
Cylindrotheca sp. | 水生生物研究所淡水藻类培养保藏中心 | FACHB-2185
Ditylum sp. | 水生生物研究所淡水藻类培养保藏中心 | FACHB-2559
Asterionellopsis sp. | 水生生物研究所淡水藻类培养保藏中心 | FACHB-2578
**寡核苷酸**
UPA99-F: GGAAACGTACAAAGGTTTCC | Liu 等 | N/A
UPA99-R: GTCGCTGCACGACTTGTAGG | Liu 等 | N/A
18S-V7F: TCCGTTAACGAACGAGACC | Zhao 等 | N/A
18S-V7R: GGCATCACAGACCTGTTATTG | Zhao 等 | N/A
PsaA-2-F: GGCACTGGATCTACACGGTA | Vinayak | N/A
PsaA-2-R: TCCGTATCACACCACAACCA | Vinayak | N/A
rbcL197-F: CTCAACCATTCATGCG | Xu | N/A
rbcL197-R: CTGTGTAACCCATAAC | Xu | N/A
DiatrbcL708F: AGGTGAAGTTAAAGGTTCWTAYTTAAA | Kezlya 等 | N/A
R3_1: CCTTCTAATTTACCWACWACTG | Kezlya 等 | N/A
Primer1-F: CAATTGGAGGGCAAGTCTGG | Li 等 | N/A
Primer1-R: CCTGCACGACAACCTAATG | Li 等 | N/A
ND-F: ATTAGGTTTATCTGGTAAAAACTAC | Yu 等 | N/A
ND-R: TTCTCTCCAACGCATGAA | Yu 等 | N/A
DNGT-F: CCGTTCTTGACTGGAATCGT | Sun | N/A
DNGT-R: AAACCACAAGGGGCTTAGGA | Sun | N/A
18S-333NF: GTGGCATTCAGTTGTCGTG | 本研究 | N/A
18S-333NR: CCCTTGTCGGCATAGTTTA | 本研究 | N/A
18S-341JF: CGTTCTGGCATTAGGTTGT | 本研究 | N/A
18S-341JR: ATCCTGAGTCGGCATAGTT | 本研究 | N/A
rbcL-256ZF: CATCGTGCTGGTAACTCT | 本研究 | N/A
rbcL-256ZR: ACGCAACAGGCATACATT | 本研究 | N/A
18S-196OF: CGGAGGTGCTTTGGTGAT | 本研究 | N/A
18S-196OR: CTGCCTTCCTTGGATGTG | 本研究 | N/A
rbcL-NF: AAACATTCCAAGGTCCAG | 本研究 | N/A
rbcL-NR: TTCACGAGCCCATAAAG | 本研究 | N/A
18S-356HF: GGGATACCCATCGTTTACT | 本研究 | N/A
18S-356HR: GATTTCTCATACGGTGCTG | 本研究 | N/A
28S-191CF: ACGGACCAAGGAGTCTAAC | 本研究 | N/A
28S-191CR: CTGGCTTCACCCTATTCAT | 本研究 | N/A
**软件和算法**
Primer Premier 5.0 | Premier | N/A
ClustalX 1.83 | Higgins D.G | N/A
**其他**
实时 PCR 仪和高解析度熔解分析仪 | QIAGEN Rotor-Gene Q | 在新标签页中打开表格

实验模型和受试者细节
**硅藻**
本研究选择了八种纯海洋硅藻作为受试对象。包括 Nitzschia sp.、Odontella sp.、Skeletonema sp.、Chaetoceros sp. 和 Navicula sp. 在内的菌株购自中国科学院海洋研究所海藻培养保藏中心，并在富集海水培养基"f/2"中培养。包括 Cylindrotheca sp.、Ditylum sp. 和 Asterionellopsis sp. 在内的菌株购自水生生物研究所淡水藻类培养保藏中心，并在 Erdschreiber 培养基中培养。培养条件：温度 21°C，光照强度 1500 勒克斯，光周期设定为 12 小时光照/12 小时黑暗。上述实验中使用的硅藻在实验前均经电子显微镜确认为正确的硅藻属。

方法细节
**硅藻 DNA 提取**
硅藻细胞具有独特的结构，拥有坚硬的硅质壳。本研究采用了一种由我们实验室在先前研究中设计和改进的硅藻 DNA 提取方法，具体细节见参考文献。

**引物筛选和设计**
文献筛选：通过文献检索，识别目前经研究验证可用的硅藻引物序列。
自行设计：从 NCBI 数据库（登录号见表 S1）检索八种硅藻的 18S、28S 和 ITS2 核糖体基因序列、线粒体 COI 基因序列以及叶绿体 rbcL、PsaA 和 PsbA 基因序列。下载完整的 FASTA 格式序列，并使用 ClustalX 1.83 进行多序列比对分析，以识别不同藻属的特异性区域。应用 Primer Premier 5.0 软件设计硅藻特异性引物。在设计引物时，除考虑引物设计的基本原则外，还应考虑高解析度熔解曲线（HRM）技术和多重 PCR 技术的原则。引物的退火温度差异应小于 4°C，否则无法在同一 PCR 系统中反应。设计使用的引物由泰合生物技术（北京）有限公司合成。

**引物验证**
使用检索到的和自行设计的引物进行梯度 PCR 扩增和 HRM 分析。梯度 PCR 扩增后，进行 HRM 分析以确定不同引物的最佳退火温度以及每种引物扩增不同硅藻产物的熔解温度。PCR 反应体系体积为 20 μL：2.0 μL DNA 模板，10 μM 特异性正向和反向引物各 1.0 μL，2×Pfu PCR Mix 10.0 μL，20×Eva Green 荧光染料 1.0 μL，以及 ddH2O 5.0 μL。PCR 反应条件如下：初始变性 95°C 5 min；随后进行 35 个循环，变性 94°C 30 s，退火 58°C（详见表 1）30 s，延伸 72°C 1 min；最后延伸 72°C 5 min。随后进行 HRM 分析：熔解温度从 60°C 逐渐升高至 95°C，速率为 0.1 °C/s。上述实验后，显示稳定且可区分 HRM 分型曲线的样品被认为通过了验证。

**多重 PCR-HRM 反应体系的建立**
在确认每个特异性引物的有效性后，建立了一个初步的多重 PCR-HRM 反应体系。由于水样通常含有混合硅藻样品，该检测体系分三步进行。首先，使用单引物测试各种硅藻物种的混合样品，以观察单引物对混合硅藻的检测能力。随后，对硅藻两两混合样品进行分析，检测不同硅藻物种之间在扩增过程中是否存在相互抑制，或因熔解温度相似导致特征峰融合，从而筛选混合引物检测。最后，混合多对引物以鉴定硅藻物种。混合样品和引物按 1:1 比例组合（DNA 浓度约为 10 ng/μL）。同时，当使用单引物扩增单株硅藻时，某些引物在扩增不同硅藻时可能表现出相同或非常相似的熔解温度，导致在鉴定未知样品时无法区分其种类。因此，我们使用多重引物进行 HRM 分析，以更好地鉴定物种。
反应体系包括：2×Pfu PCR Mix 10 μL，10 μM 特异性引物混合物各 1 μL，DNA 模板混合物 2.0 μL，20×Eva Green 荧光染料 1.0 μL，以及 ddH2O 5 μL（表 1）。反应条件为：预变性 95°C 5 min；变性 94°C 30 s，退火 58°C 30 s，延伸 72°C 1 min，共 35 个循环；最后延伸 72°C 5 min。为了确定最佳反应体系，以前述扩增条件为基准。通过调整退火温度和 dNTP 浓度等反应条件，进行多重 PCR 扩增和 HRM 分析，以增强多重 PCR-HRM 的实验功效。对于建立的多重 PCR-HRM 系统，那些能产生可区分的 HRM 分型曲线且结果稳定的系统被认为有效。

**量化和统计分析**
所有定量数据均使用 Microsoft Excel（版本 2608）进行分析。数据以 n = 3 次独立实验的均值 ± 标准差（SD）表示。计算变异系数（CV）为 SD/均值× 100%，以评估测量的重现性，并在表 S2 中报告。

补充信息 (1)
PDF (4.08 MB)
文档 S1. 图 S1–S8 和表 S1 和 S2