基于单细胞转录组与空间转录组解析肝细胞癌免疫微环境异质性及其临床意义

《iScience》：Serum Olink proteomics-based exploration of novel predictive biomarkers for necrotizing enterocolitis

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球范围内高发的原发性肝脏恶性肿瘤，其发生发展与复杂的肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment, TIME）密切相关。尽管免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）已在部分HCC患者中展现出显著疗效，但总体应答率仍有限，主要归因于TIME的高度异质性。为深入解析HCC中免疫细胞亚群的组成、功能状态及其空间组织规律，研究人员整合单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）与空间转录组（spatial transcriptomics, ST）技术，对多例HCC肿瘤及癌旁组织进行了系统分析。研究绘制了HCC TIME的细胞图谱，鉴定出多个与预后相关的免疫细胞亚群，包括具有耗竭特征的CD8+T细胞亚群、肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）亚群及调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）亚群。通过空间共定位分析，研究人员揭示了免疫抑制性细胞亚群在肿瘤组织中的空间聚集模式，并发现其与免疫治疗耐药相关基因表达特征显著关联。此外，研究构建了基于关键免疫细胞亚群比例的预后预测模型，并在独立队列中验证了其预测效能。该研究系统描绘了HCC免疫微环境的细胞与空间异质性，为精准免疫治疗策略的优化及新型生物标志物的开发提供了重要理论基础。

论文解读：肝细胞癌免疫微环境的单细胞与空间组学解析

一、研究背景与科学问题

肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其发病率逐年上升。HCC的发生发展是一个多步骤、多基因参与的复杂过程，涉及慢性肝炎、肝硬化及多种分子信号通路的异常激活。近年来，免疫治疗尤其是免疫检查点抑制剂（ICIs）的应用，为晚期HCC患者带来了新的治疗希望。然而，临床实践中观察到，仅部分患者能从免疫治疗中获益，客观缓解率仍不理想。这一现象的根本原因在于HCC肿瘤免疫微环境（TIME）存在高度的细胞组成异质性、功能状态多样性和空间组织结构复杂性。传统bulk转录组测序技术无法解析单个细胞的基因表达特征，也难以揭示免疫细胞在组织中的空间分布规律，从而限制了对TIME异质性的深入理解。因此，亟需在单细胞和空间水平系统描绘HCC免疫微环境的细胞图谱，鉴定关键免疫细胞亚群及其空间互作模式，以阐明免疫治疗耐药机制，并发现新的预后生物标志物和治疗靶点。

二、研究内容与主要结论

针对上述问题，研究人员开展了一项整合单细胞转录组与空间转录组技术的系统性研究。研究纳入多例HCC患者的肿瘤组织和配对癌旁组织样本，通过严格的质控和生物信息学分析，绘制了HCC免疫微环境的高分辨率细胞图谱。主要结论包括：

第一，研究鉴定出多个与HCC预后显著相关的免疫细胞亚群。其中，一类具有高表达耗竭标志物（如PDCD1、CTLA4、HAVCR2）的CD8⁺T细胞亚群在肿瘤组织中富集，其比例与患者总生存期呈负相关。此外，研究还发现两种功能相反的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）亚群，即促炎型TAMs和免疫抑制型TAMs，后者高表达M2型极化标志物及免疫抑制分子，与不良预后相关。

第二，通过空间转录组分析，研究人员揭示了免疫抑制性细胞亚群在肿瘤组织中的空间组织规律。免疫抑制型TAMs和调节性T细胞（Tregs）倾向于在肿瘤边缘及肿瘤核心区域形成聚集性分布，并与耗竭性CD8⁺T细胞在空间上邻近，提示存在局部的免疫抑制微环境。这种空间共定位模式与免疫治疗耐药相关基因（如TGFB1、IL10、LGALS9）的表达特征显著关联。

第三，研究构建了基于关键免疫细胞亚群比例的预后预测模型。该模型整合了耗竭性CD8⁺T细胞、免疫抑制型TAMs及Tregs的比例信息，在训练队列和独立验证队列中均表现出良好的区分效能，优于传统临床病理指标。

三、关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   单细胞RNA测序（scRNA-seq）：对HCC肿瘤及癌旁组织进行单细胞转录组测序，通过无监督聚类和细胞类型注释，鉴定免疫细胞亚群及其基因表达特征。
2. 2.
   空间转录组（ST）技术：利用空间转录组测序平台获取组织切片中基因表达的空间位置信息，结合计算算法分析免疫细胞亚群的空间分布及细胞间互作。
3. 3.
   多组学数据整合分析：将scRNA-seq与ST数据进行整合，通过反卷积算法和空间共定位分析，将单细胞水平定义的细胞亚群映射到空间组织结构中。
4. 4.
   预后模型构建与验证：基于Cox回归和LASSO回归筛选预后相关免疫细胞特征，构建风险评分模型，并在独立队列中进行验证。

研究样本来源于多中心HCC患者队列，包括手术切除的肿瘤组织和配对癌旁组织。

四、研究结果

结果一：HCC免疫微环境的单细胞图谱

通过scRNA-seq分析，研究人员在HCC组织中鉴定出包括CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、自然杀伤（NK）细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DCs）及髓系细胞在内的多种免疫细胞类型。进一步亚聚类分析揭示了CD8⁺T细胞中存在多个功能不同的亚群，其中耗竭性CD8⁺T细胞亚群高表达抑制性受体和转录因子TOX，且在肿瘤组织中显著富集。巨噬细胞亚群分析显示，免疫抑制型TAMs高表达SPP1、APOE和TGFBI等基因，与肿瘤进展相关。

结果二：免疫抑制性细胞亚群的空间分布特征

空间转录组分析显示，免疫抑制型TAMs和Tregs在肿瘤组织中呈现非随机分布，倾向于在肿瘤边界和缺氧区域富集。空间共定位分析进一步表明，耗竭性CD8⁺T细胞与免疫抑制型TAMs在空间上显著邻近，形成免疫抑制性“热点”区域。这些区域富集了TGF-β信号通路和免疫检查点相关基因的表达，提示存在局部的免疫逃逸机制。

结果三：预后预测模型的构建与验证

基于单细胞和空间分析鉴定的关键免疫细胞亚群，研究人员构建了包含耗竭性CD8⁺T细胞比例、免疫抑制型TAMs比例和Tregs比例的预后评分模型。在训练队列中，高风险组患者的总生存期显著短于低风险组。在独立验证队列中，该模型同样表现出稳定的预测效能，且与肿瘤分期和血清甲胎蛋白（AFP）水平等临床指标具有互补性。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究系统揭示了HCC免疫微环境的细胞和空间异质性，强调了免疫抑制性细胞亚群的空间聚集在肿瘤免疫逃逸中的关键作用。研究结果提示，单纯靶向单一免疫检查点可能不足以克服TIME的复杂性，联合策略应同时考虑调节TAMs极化状态和阻断Tregs的抑制功能。此外，基于免疫细胞亚群比例的预后模型有望为HCC患者的风险分层和个体化治疗决策提供工具。

研究结论部分指出，通过整合单细胞转录组和空间转录组技术，本研究全面解析了HCC免疫微环境的细胞组成、功能状态及空间组织结构，鉴定出与预后相关的关键免疫细胞亚群及其空间互作模式。这些发现为深入理解HCC免疫逃逸机制提供了新视角，并为开发新型免疫治疗策略和预后生物标志物奠定了重要基础。未来研究应进一步在更大规模队列中验证这些发现，并探索针对特定免疫细胞亚群的靶向干预策略。