女性iPSC X染色体失活侵蚀在CRISPR基因编辑和神经分化中的转录组效应

《Stem Cell Reports》：Female iPSC X chromosome inactivation erosion and its transcriptomic effects during CRISPR gene editing and neural differentiation

　　

人类诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）与CRISPR编辑通常用于研究神经发育障碍。女性iPSC逐渐丢失非编码RNA X染色体失活特异性转录本（X-inactive specific transcript, XIST）的表达，导致随机X染色体失活（X chromosome inactivation, XCI）侵蚀，并影响X连锁和常染色体基因的表达。然而，CRISPR编辑和神经分化对XCI侵蚀的影响，以及这种侵蚀如何干扰实际的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）分析，目前知之甚少。研究人员分析了针对66个基因的CRISPR编辑iPSC系的数百个RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）样本，以及匹配的单神经元RNA-seq数据。研究人员发现，CRISPR编辑的女性iPSC中存在可变的XCI，这种状态在iPSC来源的神经元中大部分被保留，且主要影响X连锁基因。机制上，XIST介导对X连锁和常染色体基因的等位基因特异性表观遗传调控，其中前者表现出更强的等位基因特异性表达（allele-specific expression, ASE）偏差，并影响神经发育基因。这些结果对基于hiPSC的神经发育障碍建模具有重要意义。

女性细胞通过随机X染色体失活（X chromosome inactivation, XCI）实现剂量补偿，其关键调控因子是长链非编码RNA X染色体失活特异性转录本（X-inactive specific transcript, XIST）。在体外培养的人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）中，XIST表达随传代逐渐丢失，导致XCI侵蚀，进而影响X连锁及常染色体基因表达。尽管XCI侵蚀现象已被确认，但CRISPR基因编辑和神经分化这两个涉及多次传代和不同细胞类型的过程如何影响XCI侵蚀动态，以及这种侵蚀如何干扰实际的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）分析，仍不清楚。此外，XIST诱导的等位基因特异性表达（allele-specific expression, ASE）偏差位点是否在不同供体间保守，也是未解之谜。基于此，研究人员依托SSPsyGene联盟开展了系统性研究。

研究人员利用CRISPR胞苷碱基编辑器在多个iPSC系中引入功能丧失（loss-of-function, LoF）突变，针对66个神经发育/精神疾病相关基因，并分化出兴奋性和抑制性神经元。细胞系来自SSPsyGene联盟的6个供体系（4女2男），包括CW20107、KOLF2.2J、CD14、CD27、GHI26和GHI49。他们采用bulk RNA-seq和单细胞RNA-seq（scRNA-seq）分析转录组，并利用基于杂合SNP的ASE分析评估等位基因表达失衡。关键方法还包括XIST表达分型、伪bulk分析、线性回归建模以及基于DESeq2的差异表达分析。研究发现：XCI侵蚀在CRISPR编辑的女性iPSC系中广泛存在，且大部分在iPSC来源的神经元中被保留。XIST表达与神经分化能力无显著关联。XCI侵蚀使XIST阴性（XIST^?）女性iPSC的X连锁基因和线粒体基因表达升高，而对常染色体基因影响微弱。ASE分析表明，XCI侵蚀对X连锁基因的等位基因失衡影响远强于常染色体基因，并在X染色体上鉴定出一个70–80 Mb的“热点”区域。在神经元中，XCI侵蚀同样主要影响X连锁基因，并导致一些神经发育相关基因出现ASE偏差。进一步的真实世界DEG分析显示，将XIST表达作为协变量与否，DEG结果存在细微但显著的差异，提示XCI侵蚀可能成为DEG分析的混杂因素。

**XIST侵蚀在CRISPR编辑的女性iPSC系中广泛存在，并在神经元分化中大部分保留**
通过分析297个iPSC系的bulk RNA-seq数据，研究人员发现编辑后的iPSC表现出供体系特异的XIST表达模式，且同一供体的不同编辑系间XCI侵蚀程度不同。传代次数（19–26）和编辑过程本身均不影响XIST表达。在234个神经元系中，大多数情况下iPSC的XIST表达状态在分化后的神经元中得以保留，仅极少数出现逆转。XIST表达水平与多能性评分或神经元分化难度无关。

**XIST侵蚀提高CRISPR编辑iPSC中X连锁和线粒体基因表达**
比较XIST^?、XIST⁺雌性系和雄性系发现，XIST^?雌性iPSC的X连锁基因表达显著升高，线粒体（mitochondrial, MT）基因表达也升高至与雄性相当的水平；常染色体基因表达仅出现微弱下调。回归分析显示XIST表达与X连锁基因平均表达呈负相关（R²=0.21），与常染色体基因无显著关联。已知的XCI逃逸基因在非假常染色体区（pseudoautosomal region, PAR）的表达在XIST^?样本中增加。

**在iPSC中，XCI侵蚀对X连锁基因的等位基因表达失衡影响强于常染色体基因**
ASE分析显示，XIST⁺组中X连锁SNP更多表现为单等位基因表达，而XIST^?组偏向双等位表达；常染色体SNP的差异较小。X连锁SNP的ASE比例在XIST⁺与XIST^?之间的相关性（R²=0.73）低于常染色体（R²=0.83），表明X连锁位点的等位基因稳定性较弱。X染色体上存在70–80 Mb的ASE偏差热点区域，该区域包含XIST及其调控因子FTX和JPX。共鉴定出25个X连锁和339个常染色体基因在不同供体系间一致受XIST影响，X连锁基因富集于TORC2信号、磷脂生物合成等生物学过程。

**单神经元中XCI侵蚀影响X连锁和常染色体基因的表达**
在scRNA-seq数据中，兴奋性神经元内XIST表达与X连锁基因平均表达呈中等相关（R²=0.31），与常染色体基因相关性较弱（R²=0.17）；抑制性神经元中相关模式类似。伪bulk比较显示，XIST^?雌性神经元的X连锁基因表达高于XIST⁺和雄性，常染色体基因无显著差异。与iPSC不同，神经元中多数已知XCI逃逸基因在XIST⁺系中未表现出逃逸，但XIST^?系中非PAR区逃逸基因表达仍增加。

**iPSC来源神经元中的XCI侵蚀影响神经发育基因的ASE偏差**
在神经元中，XIST⁺组的X连锁SNP呈现更强的单等位表达趋势，而XIST^?组更偏向双等位表达；常染色体也有类似但较弱的效应。兴奋性神经元中，X染色体70–80 Mb热点区域在不同供体间一致存在。在至少两个细胞系中受XIST影响的基因包括13个X连锁基因（兴奋性神经元）和2个X连锁基因（抑制性神经元），其中TTC3P1在所有兴奋性神经元细胞系中均受影响。此外，313个常染色体基因（兴奋性）和63个常染色体基因（抑制性）在至少两个细胞系中受XIST影响，其中22个常染色体和5个X连锁基因已被报道与神经发育障碍（neurodevelopmental disorders, NDDs）相关。这些基因富集于突触后信号、大脑形态发生等过程。

**iPSC来源神经元中的XCI侵蚀对实际转录组差异表达分析有影响**
通过线性回归，研究人员在兴奋性和抑制性神经元中分别鉴定出52个和12个X连锁基因的表达受XIST影响，其中9个为两者共享，包括ALG13、CASK、PAK3等NDD相关基因。在DEG分析中，将XIST表达作为协变量与否，各LoF基因的log2FC高度相关（Pearson R>0.85），但约20%的LoF基因的DEG列表存在中等程度差异（Jaccard相似指数0.5–0.75）。非重叠的X连锁DEG比常染色体DEG表现出更大的倍数变化差异，表明XCI侵蚀对DEG分析具有温和但显著的混杂效应。

在讨论中，研究人员指出，XCI侵蚀在iPSC来源神经元中的保留与先前在心肌细胞中的观察一致。X染色体70–80 Mb热点区域包含XIST及其正调控因子FTX和JPX，提示可能存在局部调控机制。XIST对常染色体基因的影响较弱，可能是继发性后果。因此，他们建议在DEG分析中将XIST表达作为协变量加以控制，而非简单剔除样本，以保留生物学变异。研究局限包括女性供体数量有限（4例）、iPSC传代范围较窄（19–26代）以及缺乏匹配的表观基因组数据。未来仍需系统表征基因编辑和神经元分化过程中的表观遗传变化。

研究结论：尽管存在上述局限，本研究首次在同一组CRISPR编辑的iPSC系和神经元中全面评估了XCI动态及其对X连锁和常染色体基因的转录影响。观察到的iPSC来源神经元中持续的XCI侵蚀及其对实际DEG分析的混杂效应，对改进基于hiPSC的脑部疾病建模的设计和解释具有重要意义。