基于牛津纳米孔测序技术的惰性乳杆菌DSM 13336完整染色体基因组测序及特征分析

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequence of Lactobacillus iners DSM 13336 determined by Oxford Nanopore Technologies long-read sequencing

　　摘要Lactobacillus iners（惰性乳杆菌）是人类阴道微生物群的关键成员。我们利用牛津纳米孔技术获取了DSM 13336菌株的完整基因组序列。所得的单个环状染色体（1,337,293 bp）为L. iners提供了高质量的基因组资源，突显了DSM 13336菌株的独特特征。公告Lactobacillus iners是一种革兰氏阳性、兼性厌氧细菌，代表人类阴道微生物群的主要成员。大多数生殖年龄女性的阴道微生物群由L. iners占主导地位。该物种通过产生乳酸维持较低的阴道pH值，但也经常与细菌性阴道病的微生物特征相关。目前公开可用的L. iners参考菌株基因组序列有限，且通常为草稿组装。例如，与本研究菌株密切相关的DSM 13335菌株包含12个支架。迄今为止，仅报道了一个完整的、环化的基因组，且该菌株（KY）并不公开可用。在此，我们展示了从莱布尼茨DSMZ德国微生物和细胞培养保藏中心（德国布伦瑞克）获得的L. iners DSM 13336完整基因组序列，为该具有重要临床意义的物种提供了增强的基因组资源。L. iners DSM 13336在200 mL去曼、罗戈萨和夏普（MRS）肉汤中培养，补充L-半胱氨酸和L-谷氨酰胺（MRS-CQ）。使用BD公司的GasPak EZ厌氧气体发生试剂产生厌氧气氛，在37°C下厌氧培养。23小时后收集细胞，全部生物量（1 g）用于DNA提取，使用NucleoBond缓冲液套装III和NucleoBond AXG基于硅胶的阴离子交换柱（Macherey-Nagel），按照制造商的说明操作。通过分光光度法评估DNA质量和数量，280/260和260/230比值分别为1.86和2.32，估计DNA浓度为120 ng/μL，体积为600 μL。从1 μg提取的基因组DNA制备测序文库，无需剪切或尺寸选择，使用牛津纳米孔技术公司SQK-LSK114连接试剂盒。将文库加载到带有FLO-MIN114流式芯片（R10.4.1）的MinION Mk1D上。测序运行使用MinKNOW v25.09.17控制。碱基识别使用Dorado v7.11.2（SUP模型）进行。原始输出包含3,260,254个读数，N50为5,497 bp，平均读数质量为Q18.8，估计组装覆盖度为150倍。使用Chopper v0.12.0（最低Q分数15，最短长度200 bp）进行读数质量控制和修剪。使用Flye v2.9.6进行从头组装，估计基因组大小为1.3 Mbp。随后使用Medaka v2.2.0（模型r1041_e82_400bps_sup_v5.2.0）对组装进行抛光。使用QUAST v5.3.0评估基因组质量，并使用skani v0.3.1计算相对于L. iners DSM 13335及其他已发表L. iners基因组的平均核苷酸一致性（ANI）。基因组注释使用NCBI原核生物基因组注释流水线在GenBank提交期间完成；注释统计汇总于表1。除另有说明外，均应用默认参数。表1 Lactobacillus iners DSM 13336的测序和组装统计读数数量：3,260,254总基因组长度（bp）：1,337,293读数长度N50（bp）：5,497组装覆盖度：150倍GC含量（%）：33.15预测基因数量：1,310CDS数量：1,222tRNA基因数量：67rRNA基因数量：18相对于DSM 13335的ANI（%）：98.86相对于L. iners KY的ANI（%）：98.34最终组装由一个1,337,293 bp的单个环状染色体组成，GC含量为33.15%，N50为1,337,293 bp。环状性由Flye从末端重叠推断，并在沉积的染色体序列中确认。除组装器执行或沉积期间应用的之外，未进行额外的重新定向或旋转。相对于参考菌株DSM 13335的ANI为98.86%。与其他已发表L. iners基因组的成对ANI比较（菌株KY、C0094A1和C0254C1；GenBank登录号CP048798.1、CP049223和CP049231.1）范围为98.34%至98.61%。有趣的是，Kwak等人描述了L. iners的三个潜在核心基因（INY、ZnuA和hsdR）。其中仅有两个（INY和ZnuA）在本基因组中被鉴定，核苷酸序列同一性分别为99.36%和99.67%。这些结果共同确认DSM 13336代表一个独特菌株，且本基因组为L. iners提供了完整的、高质量的基因组资源。致谢本手稿提出的研究成果由Givaudan France SAS资助。