噪声与一氧化碳联合暴露通过紧密连接蛋白的表观遗传失调损害血睾屏障完整性：紫檀芪的保护作用

《Food and Chemical Toxicology》：Combined Noise and CO Exposure Compromises Blood-Testis Barrier Integrity through Epigenetic Dysregulation of Tight Junction Proteins: Protection by Pterostilbene

　　

摘要

环境噪声与一氧化碳（CO）的联合暴露对男性生殖健康构成日益严峻的威胁，但其联合毒性的潜在机制尚未被完全阐明。本研究探讨了噪声与CO联合暴露对支持细胞和血睾屏障（BTB）的影响，探索了潜在的表观遗传机制，并评估了白皮松素（PTE）在雄性大鼠中的保护效果。动物分别暴露于噪声（85 dB）、CO（410 ppm）或两者联合暴露，持续60天，每天2小时，其中部分动物同时接受PTE处理（80 mg/kg/d）。联合暴露（而非单一因素）诱导了显著的支持细胞丢失，抑制了抑制素B（INH-B）的分泌，破坏了BTB的超微结构，并伴随包括ZO-1、N-钙黏蛋白和紧密连接蛋白家族成员在内的多种连接蛋白的协调性下调。整合转录组和甲基化组分析表明，这种多靶点连接损伤与启动子高甲基化介导的转录沉默相关，其中Cldn5、Cldn9、Cldn18和Cldn22被确定为代表性靶基因。PTE联合处理减轻了异常甲基化，恢复了连接蛋白的表达，并维持了BTB的结构完整性。这些发现提示，BTB连接基因的启动子高甲基化可能是联合暴露诱导生殖毒性的重要表观遗传机制，而PTE可能成为联合环境暴露风险人群的一种有前景的保护性干预手段。

引言

工业化在极大提升人类福利的同时，也加剧了环境健康风险，其中男性生殖健康的全球性下降已成为日益严重的全球关注焦点（Agarwal et al., 2015; Huang et al., 2017; Levine et al., 2017）。流行病学数据表明，近几十年来精子质量持续下降，目前全球有2.5–12%的男性受不育症影响，造成了巨大的社会经济负担（Huang et al., 2017）。环境毒物被认为是导致这一趋势的主要因素之一。在职业和城市环境中接触到的众多污染物中，噪声和一氧化碳（CO）是最普遍且难以避免的两种危害，它们经常同时出现在工业车间、交通繁忙路段以及装甲车辆等封闭军事舱室内（Farzadinia et al., 2016; Min and Min, 2017; Rengaraj et al., 2015; Sharma et al., 2016）。因此，了解这些共存的污染物如何共同损害男性生殖功能具有重要的公共卫生意义。

噪声和CO单独暴露均已被证实会导致动物模型和人群中精子发生受损、睾丸形态改变和类固醇合成谱异常（Farzadinia et al., 2016; Min and Min, 2017; Rengaraj et al., 2015; Sharma et al., 2016）。基于上述发现，我们此前的研究已证明噪声和CO联合暴露可协同诱导睾丸氧化应激和生殖细胞凋亡（Li et al., 2023）。然而，仅这些机制尚不足以解释所观察到的生殖毒性的全部谱系，尤其是BTB的结构破坏，提示仍有更敏感的上游调控层面有待阐明。除了这些经典毒理学终点外，环境污染物越来越多地被确认为表观基因组的干扰因子，尤其是DNA甲基化（Han and Huang, 2021; Meehan et al., 2018）。在睾丸中，DNA甲基化对雄性生殖细胞发育、生精进程和生育力维持至关重要，其异常调控经常与不育症和异常精子发生相关（Ma et al., 2018; Rotondo et al., 2021）。与此同时，白皮松素作为一种天然多酚，因其表观遗传调控能力而受到关注，包括逆转异常DNA甲基化的能力（Harithpriya et al., 2024a; Lee et al., 2018; Schmidlin et al., 2008）。尽管有这些并行的进展，这些通路在联合环境压力下如何相互作用仍是一个亟待阐明的重要挑战。

然而，现有的毒理学研究几乎完全集中于单一暴露模式，噪声和CO的联合生殖毒性尚未得到充分理解。此外，这种联合暴露是否会通过干扰睾丸DNA甲基化来沉默BTB连接基因，以及PTE能否通过表观遗传修复来抵消这种损伤，目前尚不清楚。为解决这些问题，本研究旨在表征噪声和CO联合暴露引起的支持细胞和BTB的多靶点损伤，通过整合甲基化组-转录组分析阐明潜在的表观遗传机制，并评估PTE的保护效果。我们的结果表明，联合暴露会导致睾丸组织病理学改变、显著的支持细胞丢失和BTB超微结构破坏。在机制方面，整合多组学分析和后续验证揭示，联合暴露引发广泛的启动子高甲基化，导致核心紧密连接蛋白家族基因（Cldn5、Cldn9、Cldn18和Cldn22）的靶向转录沉默，同时伴随ZO-1和N-钙黏蛋白的显著下调。重要的是，PTE给药能有效逆转这种表观遗传沉默，恢复连接蛋白的表达和定位，并成功挽救BTB的完整性。

通过将环境联合暴露毒理学与多组学表观遗传解析及天然产物干预相结合，本研究既提供了污染物诱导BTB破坏的机制见解，也为保护高危人群男性生殖健康提供了转化策略。

章节摘要

动物与处理方案

本研究使用6-8周龄、体重约200 g的雄性Sprague-Dawley大鼠，由陆军特色医学中心野战外科研究所实验动物中心提供（许可证号：SCXK（渝）2017-0006）。动物饲养于标准大鼠笼中，每日定时定量喂食，自由饮水。动物房温度维持在20°C，湿度50%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗

噪声与CO联合暴露诱导严重睾丸组织病理学改变和支持细胞损伤，PTE可改善

为评估生殖毒性，采用H&E染色检查睾丸组织病理学。空白对照和阴性对照组的睾丸结构完整，曲细精管形态规则，生殖细胞排列紧密，精子发生正常（图1A）。单独噪声或CO暴露诱导中度病理改变，表现为生殖细胞轻度崩解、曲细精管空泡化以及基底膜破坏

讨论

本研究调查了噪声和CO联合暴露对支持细胞和BTB的生殖毒性、潜在的表观遗传机制以及PTE的保护潜力。我们的数据显示，联合暴露通过多种连接蛋白的协调性下调破坏BTB完整性。在机制方面，这种多靶点损伤是由关键连接基因的启动子高甲基化介导的转录沉默所驱动。值得注意的是，PTE给药……

动物伦理声明（AMUWEC20226270）

我们确认，Jinyi Liu等人进行的"噪声与一氧化碳联合暴露对大鼠男性生殖系统的影响及其可能机制"研究所使用的动物（Sprague-Dawley大鼠，雄性，n=60）符合中国实验动物的质量控制要求。实验设计、实验操作及动物处死方法均经过第三军医大学（陆军军医大学）实验动物福利与伦理委员会审查（陆军

CRediT作者贡献声明

Jinyi Liu：指导、资金获取、构思。Xiao Jiang：指导、构思。Daibo Li：指导、构思。Lulu Guo：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、可视化、调查研究、形式分析、数据管理。Xin Wang：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、可视化、调查研究、形式分析、数据管理。Lei Sun：撰写—审阅与编辑、指导、项目管理、方法学，

伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经第三军医大学（陆军军医大学）实验动物福利与伦理委员会批准（批准号：AMUWEC20226270）

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。本研究中生成的RNA-seq和RRBS原始数据已存入基因组序列档案馆（GSA）数据库，登录号为[CRA045901]。数据可在https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/公开获取。（注：已提供审阅者令牌，便于同行评审过程中的匿名访问。）

利益冲突声明

? 作者声明，不存在可能影响本论文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢：

本研究由国家自然科学基金（资助项目编号：82173555）和国家自然科学基金重点项目（资助项目编号：82130097）资助。

Lulu Guo|Xin Wang|Zhonghao Zhang|Jiankang Wang|Chaofeng Shi|Rong Xu|Xiao Jiang|Jinyi Liu|Daibo Li|Lei Sun|Yingqing Li