《Food Chemistry: X》：Fractionation-guided profiling of silkworm pupae (
Bombyx mori) peptides: molecular features governing stage-specific fermentative performance of
Limosilactobacillus reuteri DSM 17938
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家蚕蛹肽可作为Limosilactobacillus reuteri DSM 17938的有效氮源；肽分子量与发酵阶段依赖性活性相关；1–3 kDa组分优先支持对数期生长；肽分子量和电荷共同控制L. reuteri的氮可用性；F2–1富含主要来源于脂蛋白（li
家蚕蛹肽可作为Limosilactobacillus reuteri DSM 17938的有效氮源；肽分子量与发酵阶段依赖性活性相关；1–3 kDa组分优先支持对数期生长；肽分子量和电荷共同控制L. reuteri的氮可用性；F2–1富含主要来源于脂蛋白（lipoproteins）的短链、亲水性和酸性肽。
论文围绕家蚕蛹（Bombyx mori）来源肽是否可作为Limosilactobacillus reuteri DSM 17938的功能氮源展开。益生菌（probiotics，足量摄入时对宿主有益的活微生物）在功能食品中应用广泛，L. reuteri是胃肠道共生菌，具有菌株依赖的胃肠道胁迫耐受和肠上皮黏附能力，其代谢产物reuterin具有广谱抗菌活性。益生菌存活和功能表现高度依赖营养可用性；除碳水化合物类益生元外，蛋白水解物（protein hydrolysates，蛋白质水解产生的肽和氨基酸混合物）作为易利用氮源受到关注。既往研究表明，乳酸菌对肽的利用具有选择性，受氨基酸组成、链长、疏水性、末端残基等影响；大豆来源蛋白水解物和肽可促进若干乳酸菌和双歧杆菌生长或代谢。家蚕蛹是未充分利用的富蛋白资源，酶解可提高其溶解性和功能性质，但其肽组分特征、肽谱与益生菌生长代谢之间的关系尚不清楚，已有研究多聚焦抗氧化、肌生成等活性，少涉及促益生菌生长。因此，研究人员以L. reuteri DSM 17938为模型，采用Alcalase和Flavourzyme制备家蚕蛹肽，评估其对生长、活菌数、总有机酸积累和细胞形态的影响，并通过活性导向分级（activity-guided fractionation，依据生物活性追踪分离）和肽谱分析筛选活性组分。结论是家蚕蛹肽可作为有效功能氮源，其效果不仅取决于总氮含量，还受肽分子量分布和电荷特征共同调节，并呈现发酵阶段依赖性。
研究人员使用L. reuteri DSM 17938（由Hebei Fremont Biotechnology Co., Ltd.，Handan, China提供）和家蚕蛹（购自Hechi Jinheng Biotechnology Co., Ltd.，Guangxi, China）。主要技术包括：脱脂后以Alcalase和Flavourzyme酶解制备SPP-A与SPP-F；用凯氏定氮、氨基酸分析和高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）测定蛋白、氨基酸组成及分子量分布；在MRS（de Man–Rogosa–Sharpe broth，MRS培养基）、氮限制（nitrogen-limited，LN）及等氮替代培养基中测生长曲线、活菌数、乳酸/乙酸和扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）形态；通过超滤、Sephadex G-50凝胶过滤、Q Sepharose离子交换分级；用液相色谱–串联质谱（liquid chromatography–tandem mass spectrometry，LC–MS/MS）鉴定活性组分肽序列，并以线性混合效应模型和方差分析（analysis of variance，ANOVA）分析显著性。
3.1 酶解主要产生低分子量肽（Enzymatic hydrolysis generated predominantly low-molecular-weight peptides）。通过分子量分布和氨基酸组成分析，SPP-A与SPP-F中高于5 kDa者仅0.18%，超过92%低于3 kDa，低于500 Da比例最大。脱脂蚕蛹粉中检出氨基酸在水解后均保留；SPP-A的天冬氨酸、谷氨酸等显著高于SPP-F和脱脂蚕蛹粉。结论：两种酶解物均为低分子量肽富集的氮源，但总氨基酸组成不足以解释后续生物差异，需分级解析。
3.2 SPP-A和SPP-F改善氮限制下生长性能与总有机酸积累（SPP-A and SPP-F improved growth performance and overall organic acid accumulation under nitrogen limitation）。通过MRS、LN、等氮SPP-A/SPP-F培养，测OD
600、活菌数、乳酸和乙酸及SEM。前10 h生长相似，之后两个肽组增长快于MRS和LN，SPP-A高于SPP-F。10 h后肽组活菌数显著增加，SPP-A活菌数为MRS的1.68倍、LN的1.78倍，并在14 h维持最高；18 h下降后肽组仍高于MRS和LN。10–18 h肽组乳酸和乙酸高于MRS和LN，SPP-A在14 h和18 h最高。结论：SPP-A与SPP-F均可作为有效功能氮源，SPP-A更强，推动活性导向分级。
3.3 分子大小分级揭示L. reuteri DSM 17938的阶段依赖性活性（Molecular-size fractionation revealed growth-stage-dependent activity of L. reuteri DSM 17938）。
3.3.1 SPP-F超滤组分活性（Activity of SPP-F ultrafiltration fractions）。超滤得F1（低于1 kDa）、F2（1–3 kDa）、F3（3–5 kDa）。对数期F2生长响应最强，其次F3、F1，LN差；10 h F2活菌约MRS的1.19倍且显著高于LN；14 h维持较高，18 h优于其他级分，活性高于原始SPP-F；F2对数期乳酸和稳定期乙酸最高。结论：1–3 kDa的F2最强，选其继续纯化；同时低于0.5 kDa的丰富级分可能含游离氨基酸，低分子量促生长可能部分来自小氮底物。
3.3.2 SPP-A超滤组分活性（Activity of SPP-A ultrafiltration fractions）。超滤得A1（低于1 kDa）、A2（1–3 kDa）、A3（3–5 kDa）。对数期A1、A2、A3生长率高于MRS和SPP-A；稳定期A3最高，A1/A2低于MRS。10 h A2活菌最高；14 h A3约MRS的1.10倍；18 h A3和SPP-A分别约MRS的1.12和1.05倍。10 h A2乳酸8.70 g/L、乙酸2.98 g/L，MRS为8.00和2.67 g/L；14 h和18 h A3乙酸4.07和3.89 g/L，显著高于其他。结论：A2关联早期响应，A3更好维持后期活力和酸积累，故选A2、A3继续纯化。
3.3.3 凝胶过滤将活性定位在1–3 kDa范围（Gel filtration localized activity within the 1–3 kDa range）。F2、A2、A3经Sephadex G-50得F2–1（1–2 kDa）、F2–2（2–3 kDa）、A2–1（1–2 kDa）、A2–2（2–3 kDa）、A3–1（3–4 kDa）、A3–2（4–5 kDa）。对数期F2–1、F2–2、A2–2促生长较强；稳定期F2–1和A2–2仍高。14 h F2–1活菌约MRS的1.06倍；18 h F2–1、A2–2、A3–2分别约MRS的1.06、1.02、1.08倍。结论：凝胶过滤进一步富集促生长活性，F2–1和A2–2最强，选作LC–MS/MS分析；分子量范围与蛋白源和菌株有关。
3.4 电荷分离鉴定FI-2为最一致活性组分（Charge-based separation identified FI-2 as the most consistently active fraction）。离子交换得SPP-F的FI-1–FI-3和SPP-A的AI-1–AI-4。对数期FI-2、FI-3较高，稳定期FI-2仍高，FI-1和AI-3也超过MRS。10 h AI-3和FI-2活菌约MRS的1.10和1.14倍；14 h FI-2最高，约1.10倍；18 h FI-2和AI-3保持较高。结论：电荷相关组成差异影响生长反应，FI-2最强最一致，其次AI-3、FI-1，并支持分子大小非唯一决定因素，选FI-2作LC–MS/MS。
3.5 活性组分肽谱（Peptide profiles of the active fractions）。
3.5.1 FI-2含少量主要酸性、亲水性肽（FI-2 contained a small set of predominantly acidic, hydrophilic peptides）。LC–MS/MS初鉴3013条肽，按阈值保留16条高置信肽，质量676.34–3620.89 Da，长度6–32残基；10条最丰富平均16.7残基。最丰富YPYEPTPKESEPF占3.00%，亲水，pI 4.02；第二SVVVADYDSAVEKSKHLYEEKKSEVITNVVNK占2.94%，pI 5.56；另有短疏水肽GDFPDIL、GLPDIY等共享PDIL/GLPDI基序。10条最丰富中7条、15条独特肽中12条亲水；多数pI酸性至近中性，8条低于5.0，6条在5.0–7.5，仅1条碱性9.44。结论：FI-2以亲水肽为主并含少数短疏水肽，重复重叠基序提示有限前体蛋白尤其脂蛋白经逐步酶切产生多肽。
3.5.2 F2–1富集短、亲水、酸性肽（F2–1 was enriched in short, hydrophilic, and acidic peptides）。LC–MS/MS初鉴4494条肽，116条高置信，质量375.22–1881.94 Da，57.8%在800–1400 Da；3–5、6–9、10–13、14–18残基分别占21%、33%、32%、14%。116条中77条亲水、39条疏水，约60% pI低于6.0。20条最丰富肽占47.3%，10条占31.0%，长度4–15残基，平均9.0，丰度与长度基本无关。Pro最丰富占18.9%，其次Gly 10.6%，Phe和Leu各8.3%，Asp和Ile各6.7%，Tyr 6.1%。20条中11条pI低于5.0，平均4.89。Leu常在N端并呈LP基序，Pro、Ser、Phe、Trp常为C端；重复LP、PD、DI、FP、IF基序和嵌套肽家族表明共同前体经N/C端修剪并保留稳定核心。20条中17条来自脂蛋白、3条来自表面层蛋白。结论：F2–1为短、亲水、酸性肽富集组分，候选结构特征明确，但单肽功能与摄取尚未验证。
讨论部分强调，家蚕蛹肽对L. reuteri DSM 17938的促生长性能并非仅由总氮含量决定，而由肽分子量分布和电荷特征共同调节；不同分子量级分在不同发酵阶段表现互补，1–3 kDa肽加速指数期，3–5 kDa SPP-A级分更好维持后期活力和酸积累。该研究为设计靶向促生长的家蚕蛹肽配料提供理性框架，也为未充分利用蛋白资源在功能食品和发酵中的增值提供可持续策略。局限是未合成和独立测试单个肽，其促生长活性和摄取机制未验证，分级工艺工业放大仍需研究。
4. 结论（Conclusions）
本研究系统证明家蚕蛹来源肽（SPPs）可作为Limosilactobacillus reuteri DSM 17938的有效功能氮源。Alcalase（SPP-A）和Flavourzyme（SPP-F）水解物均以低分子量组分（低于3 kDa，超过92.00%）为主。SPP-A的天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸含量显著高于SPP-F。在此条件下，SPP-A也显示更强生长响应。活性导向分级揭示了此前未被认识的阶段依赖性大小效应：1–3 kDa肽加速指数期增殖，而SPP-A的3–5 kDa级分更好维持后期活力和酸积累。这种时间互补性提示，定制肽混合物可优化整个培养周期的发酵性能。凝胶过滤和离子交换色谱进一步鉴定出F2–1（1–2 kDa）、A2–2（2–3 kDa）和FI-2为高活性级分。LC–MS/MS谱分析显示，F2–1富集短链（3–18残基）、主要亲水和酸性肽，来源于脂蛋白，含反复出现的疏水基序，可能促进细菌摄取和利用。然而，单个肽既未合成也未独立测试，其促生长活性和被L. reuteri DSM 17938摄取的作用仍有待未来研究验证。总体而言，这些发现确立了益生菌对SPPs的响应不仅取决于总氮含量，还受肽大小分布和电荷特征关键调节。该工作为设计具有靶向促生长功能的家蚕蛹来源肽配料提供理性框架，同时为在功能食品和发酵应用中增值一种未充分利用的蛋白资源提供可持续策略。未来研究应聚焦验证单个合成肽的活性、阐明转运机制，并放大分级过程以实现工业可行性。
