具有增强抗菌活性的膜活性嵌合内溶菌素sTHA-Lys的特性研究——其对食源性副溶血性弧菌的抗菌效果评估及在牡蛎中的初步应用

《Food Bioscience》：Characterization of membrane-active chimeric endolysin sTHA-Lys with enhanced antibacterial activity against foodborne Vibrio parahaemolyticus and preliminary evaluation in oysters

　　

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  sTHA-Lys 对食品borne V. parahaemolyticus 显示出快速的杀菌活性。
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  与 sTHA 的融合增强了亲本溶菌素的理论阳离子性。
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  sTHA-Lys 在不同的盐浓度、pH 值和温度范围内保持了水解活性。
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  sTHA-Lys 处理会导致膜扰动和细胞膜损伤。
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  sTHA-Lys 在冷藏储存期间减少了 V. parahaemolyticus 在牡蛎样本中的数量。

引言

Vibrio parahaemolyticus 是一种嗜盐的革兰氏阴性细菌，广泛分布于海洋和河口环境（Silvester 等，2015年），被认为是全球海鲜相关胃肠炎的主要原因之一（Park 等，2018年；Zhao 等，2022年）。V. parahaemolyticus 对水产品的污染对食品安全和公共健康构成了严重威胁，并且也导致了海鲜产业的重大经济损失（Ha 等，2023年；Siriphap 等，2024年；Xiong 等，2025年）。近年来，水产养殖和食品生产系统中抗生素的使用和滥用不断增加，促使了弧菌属细菌对抗微生物药物产生抗性（Zhang 等，2024年），这使得控制 V. parahaemolyticus 变得更加复杂。因此，迫切需要开发有效的替代抗菌剂来控制食品相关和水产养殖环境中的这种病原体（Agún 等，2025年；Dai 等，2023年）。

源自噬菌体的内溶菌素（溶菌素）作为传统抗生素的替代品引起了广泛关注（Khan 等，2024年）。这些酶能够水解细菌肽聚糖中的特定键，从而导致细胞快速裂解（Aitken 等，2025年）。由于其快速的杀菌活性、较低的耐药性诱导倾向以及易于工程改造的模块化结构，溶菌素被认为是有吸引力的抗菌候选者（Zheng & Zhang，2024年）。然而，尽管溶菌素在外施时通常对革兰氏阳性细菌表现出强烈的活性，但将其应用于革兰氏阴性细菌仍然具有挑战性（Wojciechowska，2025年）。外膜是主要障碍，因为它保护着肽聚糖层，限制了溶菌素有效接触其底物（H. M. Sisson 等，2024年）。因此，从感染革兰氏阴性细菌的噬菌体中提取的天然溶菌素在外源应用时往往表现出有限的抗菌活性。

为了克服这一限制，人们探索了几种工程策略（Lee 等，2023年）。其中，将溶菌素与可渗透外膜或具有膜活性的肽融合（通常称为 Artilysin 策略）已被开发并广泛研究，以提高溶菌素对革兰氏阴性细菌的活性（Briers 等，2014年；Tung 等，2025年）。由于这些带正电的肽可以与细菌表面的负电荷成分（如脂多糖和膜磷脂）相互作用，它们可能破坏外膜，从而促进催化结构域接触肽聚糖（Chu 等，2024年）。通过这种方式，膜通透性和细胞壁水解可以被整合到一个重组蛋白质中。尽管肽-溶菌素融合在革兰氏阴性细菌方面的研究越来越多，但针对食品borne V. parahaemolyticus 的研究仍然有限，尤其是在酶学特性、环境适应性、膜相关效应以及工程溶菌素在食品基质中的表现方面。

在我们之前的工作中，通过将具有膜活性的肽 sTHA 与 V. parahaemolyticus 噬菌体溶菌素 Lysqdvp001 融合，生成了工程化的膜活性嵌合溶菌素 sTHA-Lys（Ning 等，2023年），并在测试的肽-溶菌素构建物中表现出最强的抗菌活性。然而，那项研究主要关注工程溶菌素的设计和筛选，而 sTHA-Lys 的酶学特性、环境耐受性和膜相关效应并未得到系统研究。因此，本研究旨在表征 sTHA-Lys 的物理化学和功能特性，包括其在不同环境条件下的结构、水解活性以及对 V. parahaemolyticus 的杀菌活性。此外，还分析了细菌表面电荷的变化、罗丹明 123（Rh123）和 1,6-二苯-1,3,5-己三烯（DPH）荧光、与细胞膜通透性相关的信号、生物能量酶活性以及超微结构形态，以及外源脂多糖和肽聚糖对其抗菌活性的影响。此外，还评估了 sTHA-Lys 在冷藏储存条件下控制 V. parahaemolyticus 在牡蛎样本中的潜在应用。这些结果为评估 sTHA-Lys 作为食品安全应用中对抗食品borne V. parahaemolyticus 的替代抗菌剂提供了依据。

章节片段

细菌菌株和生长条件

V. parahaemolyticus 菌株在 2216E 培养基中于 37 °C 下培养，并在 40% 甘油溶液中于 ?80 °C 下储存，最长保存 1 年后使用。除非另有说明，否则使用 V. parahaemolyticus ATCC 17802 作为抗菌和机制实验的主要指示菌株。冷冻细菌菌株在 2216E 琼脂平板上于 37 °C 下复苏 12–18 小时后进行实验。然后将单个菌落转移到 2216E 肉汤培养基中，在 37 °C 下以 150 rpm 的转速震荡培养过夜。

嵌合溶菌素 sTHA-Lys 的生化特性

首先分析了嵌合溶菌素 sTHA-Lys 的结构及其预测的物理化学性质。结构分析显示，sTHA-Lys 保留了亲本溶菌素的 PG_binding_1 和 CHAP 结构域，同时融合了额外的膜活性肽片段，表明 Lysqdvp001 的预测催化和肽聚糖结合结构得到了保持（图 1）。两种蛋白质的预测物理化学性质总结在表 1 中。

讨论

外膜是限制溶菌素外源应用于革兰氏阴性细菌的主要障碍（Zampara 等，2020年）。在本研究中，表征了 sTHA-Lys 在 V. parahaemolyticus 中的酶学特性和抗菌行为。肽融合的一个显著后果是理论等电点从 5.97 增加到 8.75，表明其阳离子性增强。

结论

本研究系统地表征了膜活性嵌合溶菌素 sTHA-Lys 对 V. parahaemolyticus 的功能特性和抗菌性能。sTHA-Lys 保留了亲本溶菌素的关键功能结构域，表现出水解活性、增强的阳离子性质、广泛的环境耐受性和快速的杀菌活性。其抗菌效果伴随着明显的膜扰动和细胞膜损伤。

CRediT 作者贡献声明

Jingxue Wang: 编写 – 审稿与编辑、软件使用、资源管理、项目申请、资金获取、正式数据分析。Guanhua Xuan: 可视化、监督、资源管理、项目申请、概念构思。Houqi Ning: 编写 – 审稿与编辑、可视化、资金获取、正式数据分析、数据管理、概念构思。Biqian Wei: 可视化、验证、方法学研究、调查、正式数据分析。Peiji Liu: 可视化、验证、监督、方法学研究。

未引用参考文献

Sisson 等，2024年。

数据可用性

本研究中提供的所有数据均可根据要求提供。

伦理批准

本文不包含任何由作者进行的涉及人类参与者或动物的研究。

资助

本工作得到了 国家自然科学基金会（32270152）、山东省重点 研发 计划（2024TZXD046）、四川省自然科学基金会（2026NSFSC1022）、青岛科技惠及 民生 示范专项（24-1-8-xdny-27-nsh）以及中国农业研究系统（CARS-47）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

Yinfeng Wang|Peiji Liu|Biqian Wei|Hong Lin|Guanhua Xuan|Jingxue Wang|Houqi Ning