《Food Chemistry》：An NIR fluorescent probe for dynamic monitoring of β-lactoglobulin: from milk quality analysis to biological imaging
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摘要
动态监测β-乳球蛋白（β-LG）的稳定性在评估乳制品质量和理解其生物功能方面起着关键作用。虽然一些荧光探针能够实现实时监测β-LG，但要实现可靠的长期检测，需要一种具有内在稳定性的探针，并且能够克服复杂基质中的严重背景干扰和高光散射。本文介
摘要
动态监测β-乳球蛋白（β-LG）的稳定性在评估乳制品质量和理解其生物功能方面起着关键作用。虽然一些荧光探针能够实现实时监测β-LG，但要实现可靠的长期检测，需要一种具有内在稳定性的探针，并且能够克服复杂基质中的严重背景干扰和高光散射。本文介绍了一种新型近红外（NIR）荧光探针DDT，专为动态监测β-LG而设计。该探针对β-LG表现出高选择性和敏感性。通过荧光测定和基于智能手机的比色平台，使用DDT实现了对液态牛奶中β-LG的双模式定量分析。此外，DDT能够通过准确追踪β-LG的降解情况来实现对牛奶稳定性的长期监测。另外，DDT还作为一种可靠的工具，可用于动态监测活细胞和体内的β-LG吸收和分布。DDT作为食品安全诊断和生物研究的多功能工具显示出了巨大的潜力。
引言
β-乳球蛋白（β-LG）是牛乳中最丰富的乳清蛋白，是一种多功能生物活性蛋白，具有独特的脂质运载蛋白结构，包含一个疏水结构（Loch等，2012；Loch等，2015）。这种结构特性使β-LG能够有效地结合、保护并运输疏水生物活性化合物，如维生素和多酚（Li等，2025；Liu等，2023；Ren等，2022）。这一能力显著增强了敏感营养素的稳定性和生物利用度，使得β-LG成为基于乳制品的功能食品和营养保健制剂中的核心成分，从而改善了营养物质的传递效果。除了营养作用外，β-LG还表现出内在的抗肿瘤活性，可以抑制肿瘤细胞的增殖和迁移（Li等，2019）。此外，其自组装的纤维结构可作为复杂的药物递送载体（Leal等，2024；Topuz等，2025；Yang等，2024；Zhang, Meng等，2024）。这些纳米结构可以包裹化疗药物，并通过靶向配体进行功能化，从而增强在肿瘤细胞中的细胞摄取同时减少全身毒性（Ahadi-Amandi等，2025；Du等，2019；Gowda等，2025）。鉴于这种结构多样性，评估β-LG的动态稳定性成为产品质量的一个有力指标，确保了营养物质传递的一致性。同时，追踪β-LG在细胞内的运输过程对于验证其结合配体的生物利用度以及确认其抗肿瘤疗效的靶向递送机制至关重要。
荧光探针技术的进步使得能够快速检测乳制品中的各种生物活性物质，包括β-LG（Li等，2024；Li等，2024；Xu等，2025；Zhang等，2025）。特别是那些依赖于β-LG结构完整性的小分子探针，在实时无损监测这种蛋白方面表现出巨大潜力（Dong等，2006；Qin等，2026；Yan等，2025）。然而，这些探针的实际应用常常受到自身局限性的阻碍。例如，尽管喹啉红对β-LG有优异的即时响应性（Chakraborty，2022），但其光稳定性较差，从而在长时间观察过程中影响信号可靠性。除了探针本身的局限性外，牛乳复杂的基质（包含蛋白质、脂质和矿物质的混合物）也给分析带来了额外的挑战，因为非特异性结合和背景干扰会掩盖准确的检测结果（Goutam等，2021）。此外，乳制品中潜在细菌的繁殖进一步加剧了长期监测的复杂性（Rodrigues等，2024），尤其是巴氏杀菌过程可能无法完全消除所有微生物干扰，导致不可预测的背景信号。虽然这些挑战在食品系统中已经很严重，但在生物组织环境中检测β-LG则引入了完全不同的障碍。生物系统的复杂性，尤其是内源性生物分子产生的高光散射和自发荧光，严重限制了传统荧光探针的穿透深度和信噪比（Muilenburg等，2023；Shi等，2022），这使得在体内高精度追踪β-LG的细胞内运输变得困难。
在近红外（NIR）生物透明窗口（650–1700 nm）内工作的荧光探针是复杂环境中成像的强大策略（He等，2026；Li等，2024；Qin等，2025）。这一光谱区域减少了内源性生物分子的光散射和吸收，不仅降低了背景干扰，还使得与可见光探针相比能够更深地穿透浑浊介质和组织（Liu等，2025；Zhang等，2024）。迄今为止，已经成功开发并验证了许多适用于复杂环境的NIR荧光探针，特别是在实时术中导航方面（Mieog等，2022；Tian等，2022）。然而，适用于复杂食品和生物基质中可靠检测β-LG的有效NIR探针仍然很少。为了解决这一瓶颈，我们提出了一种新型NIR荧光探针DDT（图1），其对β-LG具有结构依赖的响应性，能够在复杂环境中实现β-LG的稳定和动态监测。
节选内容
化学试剂和设备
牛α-乳白蛋白和β-LG从Merck KGaA（德国达姆施塔特）获得。牛γ-球蛋白、牛血红蛋白（BHb）、牛血清白蛋白（BSA）、牛纤维蛋白原、牛胰腺α-胰凝乳酶、猪胰腺胰蛋白酶、鸡蛋白溶菌酶和鲱鱼精子DNA（hsDNA）从Solarbio（中国北京）获得。酪蛋白和其他所有化学试剂均从Energy Chemical（中国上海）购买。豆浆则从当地采购。
DDT对β-LG的选择性NIR响应性
DDT的光学性质首先在水溶液（pH = 7.4）中进行了表征。如图1a所示，DDT（3 μM）本身不发光。然而，在加入β-LG（55 μg/mL）后，它在λex = 560 nm（λem = 600–825 nm）处表现出显著的“开启”NIR荧光响应。与单独使用DDT时的荧光强度相比，强度增加了大约47.2倍（图1b），对应的信噪比（SNR）为1335.1。
结论
总之，我们成功开发了一种NIR荧光探针DDT，用于β-LG的动态监测。该探针对β-LG表现出高选择性和敏感性，这是由于DDT与蛋白质之间的特定非共价相互作用所驱动的。这种独特的结合机制使其能够对β-LG实现实时响应。此外，DDT对β-LG具有很强的结合亲和力，使其抗御来自各种成分的干扰。
CRediT作者贡献声明
Wen-Xuan Qin： 原稿撰写、实验研究、数据分析。 Jing Zhang： 验证、实验研究。 Xiang Ding： 实验研究。 Chao-Yi Song： 实验研究。 Jia-He Chen： 实验研究。 Qing Wang： 原稿撰写与编辑、数据可视化、软件使用、资源管理、方法论设计、概念构思。 Wen-Bo Liu： 指导。
动物实验
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究获得了扬州大学实验动物伦理委员会的批准（批准编号202502108）。
未引用的参考文献
Chakraborty, Ray, Singh and Pal, 2021
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或可能影响本文报道工作的个人关系。
致谢
本工作得到了江苏省的研究生研究与实践创新计划、江苏省的双创计划以及扬州绿色扬金凤凰计划的支持。感谢西南医院的研究核心设施在分子模拟方面提供的帮助。
