工程化的大肠杆菌nrfA通过调节细菌驱动的氮循环和根表铁瘤形成减少水稻镉积累

《Environmental Research》：Engineered Escherichia coli nrfA Reduces Cadmium Accumulation in Rice by Modulating Bacterial-Driven Nitrogen Cycling and Root Iron Plaque Formation

　　

•nrfA过表达大肠杆菌降低了水稻根、茎和籽粒中的镉含量。
•该菌株促进了细菌驱动的氮循环和铵态氮生成。
•该菌株抑制了反硝化作用并提高了土壤无机氮含量。
•该菌株增强了水稻根铁膜的形成和镉拦截能力。

**引言**

水稻（*Oryza sativa* L.）是全球广泛种植的主要粮食作物。随着工业和农业的快速发展，土壤镉污染已成为水稻安全生产的主要威胁之一（Guan等，2025）。农业土壤中镉污染的主要来源包括工业活动的干湿沉降、采矿与冶炼活动、污水灌溉以及长期施用磷肥和其他农用化学品（Zhang等，2026）。镉具有高土壤-植物转移性，进入水稻根系后可通过木质部和韧皮部运输至营养器官和籽粒（Zhang等，2024a）。当稻田土壤中的镉含量超过安全阈值时，会导致水稻籽粒中镉浓度升高，人体摄入后可引起肾功能损害、骨骼损伤及致癌风险（Gao等，2022；Satarug，2018）。因此，有效降低水稻对镉的吸收与积累已成为污染土壤管理和食品安全保障的核心研究焦点（Clemens等，2013）。

目前针对镉污染耕地的修复技术包括物理法、化学法和生物法。尽管物理和化学方法可有效降低土壤中镉的生物有效性，但其大规模应用往往受到高操作成本、技术复杂性和二次污染风险的限制。生物修复技术，尤其是基于微生物的策略，提供了一种环境可持续且经济有效的替代方案，因为功能微生物还可通过增强养分获取和胁迫耐受性来同时提高土壤肥力并促进作物生长（Kumar等，2025；Wang等，2024；Zhang等，2022）。修复中使用的功能菌株可将重金属转化为生物有效性较低的形态，并调节作物对镉的吸收及其在植物器官中的分配（Oro等，2024），主要通过改变土壤pH值、分泌胞外聚合物和螯合剂、调节根系生长与分泌物以及调控作物离子转运体基因表达来实现（Mo等，2022；Wang等，2025）。

除金属形态转化外，微生物还驱动土壤氮循环，其中固氮、硝化和反硝化是最受关注的过程。然而，越来越多的证据表明，一些此前被忽视的氮转化途径在特定生境中发挥着不成比例的重要作用（Kuypers等，2018）。特别值得注意的是，异化硝酸盐还原为铵（DNRA）这一微生物过程在长期淹水的稻田土壤中广泛存在。对超过200个陆地生态系统观测数据点的综合分析表明，稻田土壤中DNRA的平均速率达到1.3 mg·N/kg/天，远高于森林和草地生态系统的报告值。DNRA微生物主要为兼性厌氧菌和专性厌氧菌，它们具有特定的催化酶，能够依次将NO??还原为NO??，再还原为NH??（Cheng等，2022）。相反，另一种异化硝酸盐还原途径——反硝化作用，通过NO??逐步还原为NO??、NO、N?O或N?进行，这不仅降低了氮素保留率，还增加了温室气体N?O的排放。鉴于DNRA和反硝化竞争相同的底物NO??和NO??，DNRA微生物的普遍存在可有效抑制稻田生态系统中的反硝化作用，从而在土壤氮素保护、肥料利用效率和生态可持续性方面带来显著益处（Upreti等，2022；Wang等，2018）。

在淹水稻田土壤中，氮循环通过微生物驱动的过程与铁循环紧密耦合（Kappler等，2021）。硝酸盐还原型Fe(II)氧化微生物以NO??作为电子受体氧化Fe(II)，从而将铁氧化与异化硝酸盐还原耦合——即DNRA的第一阶段——同时促进Fe(II)氧化矿化为Fe氧化物（Jamieson等，2018；Schaedler等，2018）。这些Fe氧化物可固定镉从而降低其有效性，并有助于水稻根系表面红棕色铁膜的形成（Deng等，2020）。值得注意的是，根际微生物群及其代谢物，尤其是胞外聚合物，与Fe氧化物共同组装成覆盖根表面的凝胶状薄膜，形成根膜。该膜在水稻遭受不良胁迫时起到保护作用，促进微生物定殖并增强生物膜介导的镉固定，从而改善根系对镉的拦截能力并减轻镉对水稻的毒性（Xing等，2023；Yan等，2022）。

此外，无机氮供给的化学形态已被证明会影响水稻对镉的吸收和积累。研究表明，与NO??相比，NH??补充可使水稻幼苗根系中的镉积累量减少约五分之一，并降低地上部分镉浓度约三分之一（Zhu等，2018）。作为非必需元素，镉主要通过"搭便车"方式借助介导必需元素吸收的阳离子转运体跨细胞膜运输（Li等，2021）。与Mn2?类似，NH??添加已被观察到可显著降低根系在短时间内瞬时Cd2?内流速率（Zhang等，2022），这表明Cd2?很可能通过与NH??共享的转运体进行运输。这些证据共同表明，微生物驱动的养分循环与稻田系统中镉的迁移转化密切相关。然而，现有研究对氮循环功能微生物的关注主要集中在固氮、土壤肥力提高和植物促生长方面。氮转化微生物对作物镉吸收和积累的影响，以及根际环境中控制镉生物有效性的关键过程和功能基因，仍很大程度上未被探索，有待进一步研究。

尽管DNRA在稻田土壤中的定量贡献重要，但将细菌DNRA能力与根际镉行为直接关联的实验证据仍然匮乏。关于氮循环功能微生物的研究主要集中在固氮、土壤肥力提高和生长促进方面，而金属生物有效性则关注有限。此外，NH??介导的镉吸收抑制主要已在短期水培幼苗实验中得到验证；由工程化菌株驱动的根际NH??持续富集能否降低土壤栽培水稻茎和籽粒中的镉迁移，目前尚不清楚。更为关键的是，修改细菌中单个氮循环基因是否会影响氮-铁耦合循环以及水稻根表面铁膜的形成，仍未经验证。

细胞色素c亚硝酸盐还原酶基因*nrfA*广泛分布于细菌中，编码一种关键的周质亚硝酸盐还原酶，催化亚硝酸盐异化还原为铵——DNRA途径的关键步骤，从而调控氮代谢（Hird等，2025；Pan等，2020）。此外，*nrfA*已被证明可清除毒性代谢产物NO，并有助于维持细胞代谢稳态（Bush，2011；Clarke等，2008）。我们假设*nrfA*的过表达可增强微生物驱动的DNRA过程，从而增加根际NH??含量，并可能同时抑制反硝化作用。由此产生的NH??持续富集可能通过共享的阳离子转运途径竞争性抑制Cd2?吸收，从而减少土壤向水稻根系的镉迁移。此外，*nrfA*过表达可能影响与氮循环紧密耦合的铁循环，进一步影响根际镉的生物有效性和根表面铁膜对镉的拦截能力。

在本研究中，利用Tn5转座子系统构建了一种*nrfA*过表达的*E. coli* MG1655衍生菌株，该菌株是遗传背景明确且具有镉耐受性的良好模式菌。本研究系统调查了野生型和*nrfA*过表达*E. coli*菌株对污染稻田土壤中氮和镉形态分布、根际土著微生物群落结构和功能基因、以及水稻镉吸收积累的影响，从而评估过表达微生物DNRA过程中一个关键功能基因的效应。总体目标是阐明微生物驱动的氮循环在根-菌互作系统中调控镉生物有效性的机制，并为镉污染农业土壤的安全利用和质量提升提供科学依据。

**章节摘要**

**构建*nrfA*过表达的*E. coli* MG1655菌株**

采用*E. coli* MG1655作为宿主菌株。构建了一个包含*Plac*启动子、*nrfA*基因和氨苄青霉素抗性*Amp^R^*标记选择元件的表达盒，并将其整合到一个转座子元件中。将该元件与Tn5转座酶在体外共孵育形成转座酶复合物（图S1）。通过电转化将转座体复合物导入*E. coli* MG1655感受态细胞中。PCR鉴定成功扩增出*Plac-nrfA-Amp^R^*阳性条带，

**重组筛选与*nrfA*基因丰度验证**

为确认*nrfA*过表达菌株的成功构建，使用针对*Plac-nrfA-Amp^R^*片段的特异性引物进行了PCR分析。如图S2a所示，在工程菌中检测到预期大小的阳性扩增片段，而野生型阴性对照中未观察到相应条带。为定量测定*nrfA*基因组拷贝数，对工程菌和野生型MG1655进行了定量PCR分析（图。

**讨论**

本研究构建的*nrfA*过表达菌株在基因组水平上表现出显著增加的*nrfA*拷贝数，并在转录水平上调了*nrfA*表达，表明其具有促进微生物驱动DNRA过程的潜力。原核生物转录组分析揭示了*nrfA*过表达重塑菌株全局代谢网络的分子基础。层次聚类明显区分了两种菌株类型，证实了*nrfA*

**结论**

本研究构建的*nrfA*过表达菌株表现出增加的*nrfA*基因丰度，并上调了核糖体、氧化磷酸化和碳代谢途径，表明其能量代谢和蛋白质合成能力增强。在全生长周期水稻试验中，接种野生型和*nrfA*过表达菌株均增加了根际土壤的无机氮含量；与野生型相比，*nrfA*过表达菌株显著增加了

CRediT作者贡献声明

李晓宇：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原始草稿，可视化，调查研究，形式化分析，数据管理。
袁明新：可视化，方法学，调查研究。
严鹏：可视化，调查研究。
杨琪：可视化，调查研究，形式化分析。
尚莹：方法学，调查研究。
黄永春：写作 – 审阅与编辑，方法学。
孙跃冰：方法学，调查研究。
薛伟杰：方法学，调查研究。
王昌荣：写作 – 审阅与编辑，

**未引用参考文献**

ALABA，2022；ZHANG等，2022。

**利益冲突声明**

? 作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

**致谢**

本研究得到国家重点研发计划（2022YFD1700103）、国家自然科学基金（32471707和42207039）以及中央级公益性科研院所基本科研业务费（1610022026012）的资助。

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