汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）作为类干酪培养基中抗疣孢青霉（Aspergillus westerdijkiae）生长及其赭曲霉毒素A产生的潜在生物防治剂

《Current Research in Food Science》：Debaryomyces hansenii as potential biocontrol agent against Aspergillus westerdijkiae and its ochratoxin A production on cheese-like medium

　　

：疣孢青霉（Aspergillus westerdijkiae）是一种能够产生赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）的真菌物种，该毒素对人类和动物健康具有不良影响。由于OTA构成重要的食品安全关切，且干酪已被报道为消费者暴露的潜在来源，因此亟需有效的缓解策略。汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）是一种从多种环境中分离得到的酵母菌，具有较高的生物技术潜力，尤其在食品工业中。该酵母通常与干酪成熟过程相关，并先前已在发酵食品中显示出对产赭曲霉毒素真菌的拮抗活性，但目前尚无证据表明其在成熟干酪中对疣孢青霉具有此类活性。因此，本研究旨在探究汉逊德巴利酵母ITEM 19968在类干酪培养基上抑制13株疣孢青霉菌株生长及OTA产生的能力。研究人员将酵母掺入培养基中，并在培养至20天后与未处理的对照组比较真菌生长和OTA产生情况。获得的结果表明，汉逊德巴利酵母的存在自接种后10天起降低了真菌生长，20天后的抑制值介于17%至31%之间。此外，所有产OTA菌株的OTA产生均减少了63%至100%，其中6株菌株观察到完全抑制。OTA积累的显著减少超过了真菌生长的减少幅度，提示汉逊德巴利酵母可能同时影响真菌发育和真菌毒素生物合成。这些发现强调，汉逊德巴利酵母作为干酪成熟过程中的生物防治剂候选菌株具有良好前景，可减少OTA污染并提高食品安全性。

论文解读：

成熟干酪作为一种广受喜爱的发酵食品，在成熟过程中经历复杂的微生物学和生物化学变化，这些过程对形成各干酪品种特有的风味和质地至关重要。在生产阶段，真菌被有意引入作为次级发酵剂以增强特定感官特性。然而，部分真菌物种能够产生真菌毒素，这些次级代谢产物对人类健康和最终产品质量均构成风险，使这一问题成为保障食品安全的紧迫议题。其中，疣孢青霉（Aspergillus westerdijkiae）经常与包括干酪在内的不同食品基质中的赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）污染相关。OTA是最重要的真菌毒素之一，具有肾毒性、免疫毒性和致畸性，被国际癌症研究机构列为2B类代谢物，即可能的人类致癌物。目前，干酪中OTA的检出已有充分文献记录，且根据欧洲食品安全局关于OTA风险评估的科学意见，干酪被确定为某些消费群体慢性膳食暴露的贡献食品类别之一，进一步凸显了在乳制品中制定有效缓解策略的必要性。然而，目前尚无关于干酪中OTA水平的立法，这强调了持续监测和制定预防真菌污染策略以确保食品安全的必要性。

一种有前景的方法是使用天然生物防治剂（biocontrol agents，BCAs），即对产毒霉菌具有拮抗作用的有益微生物，理想情况下在安全性和质量以及对产品感官特征方面均无不良特性。在可能的拮抗微生物中，酵母菌因其适合作为生物防治剂的特性而被广泛研究，尤其是在葡萄、苹果、柑橘和芒果等水果上。汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）是一种从不同环境中分离得到的酵母菌，以其在多种条件下生长的能力著称，在食品工业中具有显著的生物技术潜力。它是从干酪中分离得到的主要酵母物种之一，在干酪成熟过程中发挥重要的代谢活性，并限制有害腐败细菌的生长。汉逊德巴利酵母作为保护性培养物的使用不涉及食品安全风险，自2007年起已被纳入欧洲合格安全推定（Qualified Presumption of Safety，QPS）框架。此外，已有报道表明汉逊德巴利酵母能有效限制发酵肉制品中的产赭曲霉毒素真菌，但目前尚无证据表明其对成熟干酪中的疣孢青霉具有此类能力。其拮抗活性可能涉及不同机制，包括营养竞争以及调节真菌生长和OTA产生。这一数据缺失代表了一个特别相关的空白，因为发酵肉制品与成熟干酪之间的生态邻近性提示可能发生类似的拮抗相互作用。此外，考虑到汉逊德巴利酵母在乳制品环境中的普遍性及其在其他发酵食品中已证实的拮抗作用，这些因素共同为评估该酵母是否能在干酪中发挥类似保护效果提供了有力依据。据研究人员所知，这是首次研究汉逊德巴利酵母在类干酪培养基中对疣孢青霉生长及相关OTA产生的体外抑制效果。

研究人员开展了以下研究：共使用13株疣孢青霉菌株和汉逊德巴利酵母ITEM 19968，其中12株真菌分离自洞窟干酪表面，菌株ITEM 9607分离自高粱，为疣孢青霉的模式菌株。研究选用卡乔卡瓦洛干酪基质制备类干酪培养基（Cheese Agar，CA），将汉逊德巴利酵母悬液加入融化培养基中，并以对称三角形图案接种真菌孢子。在25°C黑暗条件下培养20天，分别在接种后5、10、15和20天评估菌丝生长，20天后采用免疫亲和柱净化结合高效液相色谱-荧光检测法测定OTA含量，并通过单因素方差分析和Tukey事后检验进行统计分析。

研究结果部分如下：

3.1 菌丝生长：在5天时，各菌株的抑制值差异较大，范围从?17%至35%，部分菌株出现明显的生长刺激现象。在10天时，所有菌株均呈现正向抑制值，范围从17%至31%。在15和20天时，抑制值总体保持稳定，与10天时观察到的水平相近。其中菌株ITEM 19094始终显示最高抑制率（31%），其次为ITEM 19083（29%）、ITEM 17444（28%）和ITEM 9607（26%），而较低的抑制值见于ITEM 18008（17%）、ITEM 18015（20%）和ITEM 19082（20%）。

3.2 赭曲霉毒素A产生：在20天时，所有产OTA菌株的OTA产生均显著减少，减少幅度从63%至100%。菌株ITEM 9607、ITEM 18032、ITEM 19082、ITEM 19084、ITEM 19092、ITEM 19094和ITEM 19095观察到完全抑制（100%），其余产OTA菌株的减少幅度在63%至93%之间。菌株ITEM 19083未产生可检测的OTA，与在YES培养基上的初步测定结果一致，表明其为不产OTA菌株。仅接种汉逊德巴利酵母的平板上未检出OTA。各菌株间的OTA产生减少百分比无显著差异。总体而言，无论菌株初始产毒潜力如何（对照组中OTA范围从5至1603 μg/kg），汉逊德巴利酵母均显著抑制所有 tested 疣孢青霉菌株的OTA产生。

讨论部分总结：成熟干酪在成熟过程中可能出现不良真菌生长，导致腐败和包括OTA在内的有害真菌毒素产生。酵母菌与化学防腐剂不同，天然存在于乳制品环境中，且在食品发酵中具有安全使用历史。汉逊德巴利酵母是许多成熟干酪表面自然存在的主要酵母物种之一，是干酪成熟微生物群的重要组成，通过蛋白水解和脂肪水解活性、风味发展和表面脱酸作用对干酪成熟产生积极贡献。因此，其作为生物防治培养物的使用预期与干酪制造和成熟过程相容。研究结果表明，汉逊德巴利酵母ITEM 19968在类干酪培养基上对所有 tested 疣孢青霉菌株具有显著的生物防治潜力，尽管作用时间因菌株而异。从0至5天，真菌与酵母之间的相互作用具有异质性，13株中有5株出现明显的生长刺激。相比之下，在10至20天之间，所有菌株均表现出菌丝生长减少，抑制值从17%至31%。15至20天间相对稳定的抑制值可能表明汉逊德巴利酵母随时间的持续拮抗效应，但也应考虑菌落扩展导致平板可用空间逐渐减少可能部分限制了进一步的径向生长。这一时间模式提示汉逊德巴利酵母与疣孢青霉之间的相互作用是动态的，决定相互作用结果的机制可能在共培养过程中发生变化。5天时观察到的明显刺激不应被解释为缺乏拮抗活性，而可能反映汉逊德巴利酵母在类干酪环境中的初始定殖阶段，酵母适应底物并通过代谢活动逐步改变其理化特性。此外，汉逊德巴利酵母的存在有效减少了63%-100%的OTA产生，结果表明真菌生物量的减少本身并不能完全解释OTA积累的减少。先前研究已证明汉逊德巴利酵母对OTA的减少不能仅用生长抑制来解释，酵母可能通过下调参与毒素产生的基因以及将OTA吸附到酵母细胞壁来直接干扰OTA生物合成。这些机制可能有助于解释本研究中观察到的OTA积累减少在比例上大于真菌生长减少的现象。值得注意的是，所有 tested 菌株中OTA产生的显著减少相对于真菌生长而言，提示汉逊德巴利酵母不仅限制真菌增殖，还影响参与真菌毒素生物合成的代谢途径。未来研究应调查酵母是否代谢或结合真菌毒素；通过限制真菌生长抑制真菌毒素产生；干扰代谢途径；将真菌毒素物理吸附或包埋到酵母细胞中；或产生包括挥发性有机化合物在内的细胞外抗真菌代谢物。然而，本研究是在使用类干酪培养基的受控实验室条件下进行的，可能无法完全再现真实干酪生态系统的复杂性。此外，拮抗效应在共培养10天后才变得明显，提示潜在的体内应用可能需要酵母至少活跃这一时间才能发挥有效的生物防治作用。由于实验在类干酪培养基上进行，无法评估汉逊德巴利酵母ITEM 19968对成熟干酪感官特性的潜在影响，因此需要在实际制造链条件下进一步研究其有效性，包括对不同干酪品种的影响、与本地微生物群的相互作用、对感官特性的影响以及技术适用性。

结论部分翻译：本研究证明，汉逊德巴利酵母ITEM 19968在使用类干酪培养基的相同实验室条件下，显著减少了从不同干酪和地理产区收集的13株疣孢青霉菌株的生长及相关OTA产生。这些发现支持汉逊德巴利酵母ITEM 19968作为干酪成熟过程中生物防治剂的潜力，有助于开发更安全的乳制品。然而，这些发现特定于ITEM 19968菌株和本研究采用的实验条件。因此，需要涉及其他汉逊德巴利酵母菌株的研究以及在真实干酪成熟条件下的验证，以确认这种生物防治方法的适用性。未来研究还应侧重于优化应用策略，并评估该酵母在成熟干酪制造链条件下的长期稳定性和性能。