《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》：Identification and functional validation of GREM2 and PIK3C2G as senescence-associated genes in esophageal squamous cell carcinoma
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摘要食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种侵袭性恶性肿瘤，临床预后极差，而细胞衰老如何调控ESCC的生物学行为目前仍知之甚少。本研究将TCGA-ESCC队列的转录组特征与一组精选的细胞衰老相关基因相结合，以识别并功能验证ESCC中与衰老相关的调控因子。通过单因素Cox回归分析和共识
摘要 食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种侵袭性恶性肿瘤，临床预后极差，而细胞衰老如何调控ESCC的生物学行为目前仍知之甚少。本研究将TCGA-ESCC队列的转录组特征与一组精选的细胞衰老相关基因相结合，以识别并功能验证ESCC中与衰老相关的调控因子。通过单因素Cox回归分析和共识聚类，将ESCC患者分为具有不同生存结果的两种分子亚型。通过差异表达分析、随机森林优先级排序以及在GSE20347队列中的独立验证，我们确定了GREM2和PIK3C2G为首选候选基因。这两者在ESCC肿瘤和细胞系中均一致下调，且低表达预示总生存期更差。获得功能与丧失功能实验表明，GREM2和PIK3C2G可驱动p16/p21依赖性的细胞衰老，触发衰老相关分泌表型（SASP），并限制食管上皮细胞的增殖。免疫相关性分析将这两个基因与肿瘤微环境中的免疫细胞浸润、趋化因子信号传导和MHC分子表达联系起来。这些发现确立了GREM2和PIK3C2G作为ESCC中与衰老相关的肿瘤抑制因子，提供了候选生物标志物，并为探索该疾病中靶向衰老的治疗策略提供了理论依据。
引言 食管鳞状细胞癌（ESCC）是食管癌最主要的组织学亚型，起源于食管的复层鳞状上皮，其分子标志物特征与食管腺癌明显不同[1]。ESCC表现出侵袭性生物学行为，预后较差，即使经过多模式治疗，五年生存率仍低于20%[2]。在全球范围内，ESCC约占所有食管癌病例的80%，每年新增病例超过60万例[3]；其死亡率与其发病率高度吻合，主要原因是发现时多已处于晚期。高发地区形成了一个独特的"食管癌带"，包括东亚、东非和南美洲[4]。ESCC带来的沉重疾病负担凸显了深入研究其病理机制并开发有效治疗策略的迫切需求。
ESCC的病因涉及遗传改变、环境暴露和微生物失调之间的复杂相互作用。诸如EGFR和PI3K/AKT/mTOR等致癌通路常被激活，而包括TP53和CDKN2A在内的肿瘤抑制基因则常被失活[5]。NOTCH1、FAT1和PIK3CA中的反复基因组突变，加上表观遗传失调，进一步加剧了ESCC的分子复杂性[6]。环境危险因素具有地域差异：在西方人群中，烟草和酒精发挥协同作用，而在流行地区，腌制食品中的亚硝胺、热饮造成的热损伤以及微量营养素缺乏则是主要危险因素[7]、[8]。新出现的证据也表明乙醛脱氢酶2（ALDH2）多态性以及肿瘤微环境中具核梭杆菌的富集与ESCC的发病机制有关[9]。
细胞衰老是由DNA损伤、致癌基因激活和端粒磨损引起的稳定细胞周期停滞状态，在癌症生物学中发挥着关键的双重作用[10]、[11]。最早由Hayflick和Moorhead描述，衰老细胞表现出明显的形态改变，并分泌多种促炎细胞因子和蛋白酶，即所谓的衰老相关分泌表型（SASP）[12]。尽管癌基因诱导的衰老通过p53/p21和p16/RB通路作为肿瘤抑制机制发挥作用[13]、[14]，但SASP可以通过增强血管生成和免疫逃逸来促进肿瘤进展。最近的单细胞RNA测序研究在ESCC微环境的肿瘤相关成纤维细胞中鉴定出衰老特征的富集，提示其可能在疾病进展中发挥作用[15]。然而，细胞衰老与ESCC特异性驱动因素——如TP53突变和PI3K/AKT通路失调——之间的具体机制联系仍未得到充分理解。
目前ESCC的治疗策略效果欠佳，超过70%的患者在晚期才得到诊断。包括铂类化疗联合放疗、靶向药物和免疫检查点抑制剂在内的传统治疗手段常常受限于药物耐药性和缺乏稳健的预测性生物标志物[16]。因此，在衰老靶向策略的转化应用方面仍存在显著的临床空白。尽管fisetin和槲皮素等衰老溶素在前临床ESCC模型中显示出抗肿瘤活性[17]、[18]、[19]，但其在人体试验中的疗效仍未得到确立。此外，尽管SASP的某些成分（如GDF15和PAI-1）已被提议作为预后生物标志物，但其在患者分层或治疗监测中的效用仍未得到充分探索[20]、[21]。这些未解决的问题凸显了阐明细胞衰老相关基因（CSRGs）调控ESCC生物学行为的确切机制的迫切需要。整合多组学方法、空间解析蛋白质组学以及患者来源的类器官模型，或许能够揭示衰老程序如何与ESCC特异性基因组改变和肿瘤微环境相互作用。这些洞察可能为选择性清除衰老细胞或调控SASP的新型治疗策略铺平道路，从而最终改善这种致命恶性肿瘤的预后。
在本研究中，我们分析了与ESCC相关的转录组数据集，以识别并验证关键的细胞衰老相关基因。利用生物信息和机器学习方法，我们探索了所涉及的通路功能，并构建了基于表达的候选标志物模型。我们的研究结果旨在为ESCC的临床诊断和治疗提供新的见解。
章节摘录 数据来源 食管癌的转录组数据及相应的临床注释从UCSC Xena平台（
https://xena.ucsc.edu/ ）获取，作为训练队列。为获得纯的食管鳞状细胞癌（ESCC）数据集，我们下载了完整的临床元数据，并使用histological_type字段（如TCGA临床数据中所注释的）应用严格的组织学筛选。仅保留诊断为"食管鳞状细胞癌"（ICD-O-3编码8070/3）的病例
基于衰老相关基因的ESCC分子分型 为确保我们的发现专门针对ESCC，我们首先确认了本研究中所有使用的TCGA样本在组织学上均被分类为ESCC，如材料与方法部分所述。经过筛选的训练队列由82个ESCC肿瘤和11个邻近正常食管组织组成，未纳入腺癌或混合组织学病例。我们获得了279个细胞衰老相关基因（CSRGs）的精选集合，来自CellAge数据库[24]、[25]。单因素Cox
讨论 在本研究中，我们证明细胞衰老相关基因的转录异质性定义了两种具有不同临床结局的ESCC分子亚型，并鉴定出GREM2和PIK3C2G为该恶性肿瘤中两个功能相关的、与衰老有关的肿瘤抑制候选基因。这两个基因在ESCC肿瘤和细胞系中常下调，其低表达与较差的总生存期相关，而它们在ESCC细胞中强制表达足以
CRediT作者贡献声明 赵伟峰（Weifeng Zhao）： 撰写–初稿、形式分析、数据整理。赵舒燕（Shuyan Zhao）： 软件、资源。王超杰（Chaojie Wang）： 验证。董关中（Guanzhong Dong）： 形式分析。崔发财（Facai Cui）： 可视化、验证。王梦瑶（Mengyao Wang）： 撰写–初稿、项目管理、数据整理。林志锐（Zhirui Lin）： 撰写–审阅与编辑、撰写–初稿、概念构思。
伦理批准 用于QPCR分析的ESCC新鲜活检标本，由广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤生物库从患者体内手术切除获得。所有组织样本采集和分析程序均经广州医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准（批准号：GYZL-2024-KY56）。已从所有个体参与者获得知情同意。所有程序均按照《宣言》执行
作者贡献 Z -R.L.和M-Y.W.构思并监督了本研究。W
F.Z.和S
Y.Z.参与了研究设计并执行了大部分实验。C-J.W、G-Z.D和F
C.C.参与了生物统计和生物信息学分析。W
F.Z.和S
Y.Z.撰写了稿件。所有作者均讨论了研究结果并批准了最终版本。
伦理声明 已获所有参与者或其法律代表的书面知情同意，同意参与本研究并发表本文。参与者的隐私权利已得到尊重。
本研究涉及器官或组织供体。本研究包含人类生物材料，并已获得供体、其近亲或法律代表的同意，同意在本研究中使用并发表本文。本研究中使用的样本并非来源于被执行
资金支持 本工作得到了广东省自然科学基金 （2023A1515030229）和广州市科技和创新委员会 （2025A04J3972）的资助。
Weifeng Zhao|Shuyan Zhao|Chaojie Wang|Guanzhong Dong|Facai Cui|Mengyao Wang|Zhirui Lin
河南大学人民医院、郑州大学人民医院、郑州大学附属人民医院肿瘤科，河南省郑州市450003，中华人民共和国
F.Z.和S
