用于通过液相色谱-质谱法分析工业食品接触表面上消毒剂和杀菌剂残留物的采样与定量方法

《Analytica Chimica Acta》：Sampling and quantification method for the analysis of disinfectant biocide residues on industrial food contact surfaces by liquid chromatography-mass spectrometry

　　• 优化了表面采样方法，并通过LC-MS/MS技术验证了QACs和AMPD的定量
• 用乙醇/水浸透的棉布被确定为最佳的采样载体
• QACs和AMPD在食品接触表面上表现出与物质相关的持久性
• 食物残渣对从不锈钢表面回收AMPD有显著影响
• 在农业食品加工设施中识别出残留物积累的关键区域

引言
在农业食品生产环境中，常规应用清洁和消毒（C&D）程序来控制食品接触表面的微生物负荷并确保消费者安全。尽管实施了严格的卫生标准，但不足的C&D程序仍然是一个持续存在的食品安全风险。特别是，即使经过多次消毒，单核细胞增生李斯特菌等病原菌仍能在加工表面上存活，这可能与亚抑制浓度的QACs有关，这种浓度梯度促进了细菌的适应性和对临床相关抗生素的交叉抗性[1]。例如，Salmonella Agona的暴发[3]和瓶装水中检测到的铜绿假单胞菌[4]都凸显了表面卫生状况不佳所带来的持续微生物风险。
在此背景下，欧盟委员会制定了透明食品安全和卫生政策指南，特别是通过欧洲法规（EC）No 852/2004[5]来规定。该法规要求农业食品行业对所有与食品接触的表面实施有效的C&D程序，以将微生物负荷降至保障消费者安全的水平。为此，用于食品加工的杀菌产品必须满足双重监管要求：一方面，根据法规（EC）No 852/2004，它们必须在食品接触环境中有效且安全；另一方面，所含活性物质必须获得批准或正在接受审查，以便纳入法规（EU）No 528/2012附录V的第四类产品（PT4）[6]，该法规由欧洲化学品管理局（ECHA）[7]负责管理杀菌产品的市场准入。
在PT4类别下注册的消毒剂中，两亲性杀菌剂因其洗涤剂和消毒性能而成为重要的一类[8]。季铵化合物（QACs）是这类产品中最常用的活性物质，广泛应用于乳制品、肉类和蔬菜产业。主要代表包括苄基二甲基烷基铵氯化物（BACs）和二烷基二甲基铵氯化物（DDACs）。另一类属于PT4的烷基（乙基苄基）二甲基铵氯化物（ADEBACs）也存在于农业食品工业中使用的杀菌产品配方中。
另一种日益受关注的活性物质是N-(3-氨基丙基)-N-十二烷基丙烷-1,3-二胺（AMPD），它常与QACs混合使用或作为独立的消毒剂。与QACs类似，AMPD也具有两亲特性，通过破坏微生物细胞膜发挥杀菌作用，其在酸性和中性pH下的 protonated 形式尤其活跃[9]。尽管尚未获得批准，但AMPD目前正在接受ECHA的审查，以确定其在PT4应用中的使用可行性[7]。
QACs的杀菌活性源于其两亲结构[10]（图1），包括亲水的季铵头部和疏水的烷基链。这种结构使它们具有破坏膜的能力[12]。QACs与细菌的细胞膜相互作用并最终融合，导致细胞内容物释放[13]。这种杀菌效果取决于烷基链的长度（C8至C18）及其在消毒剂配方中的比例。
除了杀菌性能外，QACs还对带负电荷的表面（包括农业食品加工中使用的主要食品接触材料——不锈钢）具有高度亲和力。这种亲和力导致分子吸附在表面微观结构上，且表面粗糙度越高，残留物积累就越明显[14]。在重复的清洁和消毒循环中，尤其是在冲洗不足、操作不当或设备难以触及的区域，QAC残留物会逐渐累积[15]。AMPD（图1）同样可以吸附在食品接触表面上，其pH依赖性的两亲特性有助于其杀菌效果和在表面的持久性[9]。
因此，这些活性物质被广泛应用于各种专业和家用消毒产品中。例如，它们可用于消毒工业和食品表面、家庭台面或手部卫生。从农业食品加工到职业和运输环境，基于QAC的消毒剂被广泛使用，推动了适用于不同场景的表面采样方法的发展[15][16][17][18]。
在食品领域，QACs（尤其是BACs和DDAC-C10）对食品的污染已有充分记录[19][20][21][22][23]。自欧洲食品安全局（EFSA）在2012年和2013年发布调查结果[24]（显示冰淇淋中的BACs和DDAC-C10含量高达mg.kg-1）以来，已开发出多种分析方法以满足监管要求。目前，这些物质在欧盟委员会法规（EU）No 2023/377[25]中为植物源和动物源产品设定了特定最大残留限量（MRL），分别为DDAC(C8-C12)和BAC (C8-C18) 50或100 μg.kg-1。然而，对于其他类别的食品（如加工食品），尚未制定MRL。在没有特定MRL的情况下，食品产品中的默认MRL为10 μg.kg-1[26]。这影响了包括DDAC C14-C18、ADEBACs和AMPD在内的多种化合物。后者作为QAC的替代品，虽然最近被杀菌产品制造商提出，但关于其作为消毒剂的使用和在食品中的存在的研究较少[27]。尽管如此，在我们之前的研究中[28]，在乳制品中检测到超过10 μg.kg-1的AMPD残留物，这引发了是否需要制定特定监管阈值的问题。
目前，法规主要关注食品本身的污染问题，而没有规定消毒剂残留物直接留在食品接触表面上的可接受阈值。为了计算杀菌剂残留物从表面转移到食品中的量，ARTFood草案提案[29]提供了一种基于最坏情况下的一级筛选方法，假设如下：i) 100%的杀菌剂残留物从表面转移到食品中；ii) 每公斤食品接触面积为0.2平方米；iii) 未考虑由于重复使用导致的活性物质随时间积累。基于这些保守的最坏情况假设和已知的MRL，可以估算出一个表面警戒水平，即可能导致食品中超过MRL风险的杀菌剂表面浓度。因此，对于BACs和DDAC(C8-C12)，该警戒水平为0.5 mg.m-2（50 ng.cm-2）；对于其他QACs和AMPD，则为0.05 mg.m-2（5 ng.cm-2）。

尽管QACs被广泛使用，但直接检测和定量食品接触表面上杀菌剂残留物的有效分析方法仍很少。文献中描述的采样方法主要依赖棉签或拭子收集表面残留物，随后进行化学分析。在食品工业中，最常用的是分光光度法[15]。Mousavi等人[15]验证了一种基于棉签的分光光度法，使用Eosin-Y/Triton X-100比色离子对反应来定量不锈钢表面的QACs，检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.53 mg L-1和1.77 mg L-1。虽然该方法操作简单且适用于常规筛查，但它无法区分不同的QAC同系物，并且缺乏食品安全相关微量水平所需的灵敏度。在一项补充研究中，同一团队研究了表面材料性质（粗糙度和疏水性）对采样效果的影响，发现QACs在不锈钢表面的回收率可达82.1%，而PVC等疏水材料的回收率低至42.1%[14]。这两项研究都没有评估采样载体材料本身对回收效率的影响，这是一个普遍存在的问题[14]。此外，还探索了基于比色指示剂的快速原位筛查方法[18][19][30]。Serra-Mora等人[18]使用Chromo Azurol S/铝试剂在废水和表面上检测QACs，而Burel等人[30]证明溴酚蓝可用于检测硬质非多孔表面上的DDAC-C10残留物，检测限为100 ppm。尽管这些比色方法操作简便且快速，但在分析方面存在关键局限性：首先，它们无法区分结构相似的化合物（例如BACs和DDACs产生相同的光谱响应，无法区分单个同系物）；其次，它们的检测限通常比食品安全警戒水平高出三个到四个数量级，不适合微量水平的监管监测。此外，还研究了基于纳米粒子的比色传感器作为更敏感的替代方案[31]，但其特异性仍不足。
液相色谱与串联质谱（LC-MS/MS）结合是食品和环境基质中QACs和AMPD微量、特异性定量的参考技术[20][21][22][23][28][32]。然而，其直接应用于表面采样的研究仍然较少。LeBouf等人[17]将拭子采样与UPLC-MS/MS结合，用于工作场所环境中职业暴露评估，五种QAC同系物的检测限达到0.3–2 ng mL-1。Lazofsky等人[16]进一步优化了这种LC-MS/MS表面采样方法，用于监测公共运输工具在密集消毒后的QAC污染情况，比较了十种拭子材料和四种提取溶剂，八种QAC的检测限低至0.007–2.1 ng mL-1，表明采样载体和浸渍条件的选择对回收率有显著影响。然而，这类系统性的样本制备参数评估在文献中较为少见，且没有研究专门针对食品接触不锈钢表面在相关条件下的情况[29]。因此，本研究的核心是优化采样载体、浸渍溶剂和提取条件。这些研究为基于LC-MS/MS的表面采样方法奠定了方法论基础，但目前尚无方法能同时满足农业食品环境中的特殊要求：食品污染干扰、不锈钢作为基底、AMPD的共分析以及LC-MS/MS定量的正式验证。据我们所知，尚未有方法同时满足所有这些要求。
因此，本研究的目的是开发并优化一种针对14种QAC同系物和AMPD在不锈钢食品接触表面残留物的采样方法，并通过LC-MS/MS进行定量验证。系统评估并比较了采样载体、浸渍溶剂和提取条件，特别关注了AMPD的行为（这是一种新兴活性物质，目前尚未有相应的表面分析方法），以及常见食品污染条件对回收率的影响。所建立的分析方法随后在农业食品技术中心的实际应用中得到了验证，证明了其作为表面卫生控制实用监测工具的适用性。

分析参考标准及内标
选定的季铵标准：苄基二甲基辛基铵氯化物（BAC-C8，98.1%）、苄基二甲基癸基铵氯化物（BAC-C10，98.1%）、苄基二甲基十二烷基铵氯化物（BAC-C12，99.2%）、苄基二甲基十四烷基铵氯化物（BAC-C14，99.2%）、苄基二甲基十六烷基铵氯化物（BAC-C16，99.5%）、苄基二甲基辛十八烷基铵氯化物（BAC-C18，98.6%）、二辛基二甲基铵溴化物（DDAB-C8，96.3%）、二癸基二甲基铵溴化物（DDAB-C10，99.2%）。

方法优化
对于所有实验和给定浓度，回收率按以下方式表示：
此总体回收率反映了从表面回收的残留物及其随后从采样材料中提取的比例，即最终可用于LC-MS/MS定量的残留物部分。

结论
据我们所知，本研究首次提出了一种全面的多残留分析方法，能够检测和定量不锈钢表面的QACs和AMPD，这种材料在食品工业中广泛应用。采用了一种既敏感又实用的方法，结合了通过实验确定的表面采样技术和经过验证的LC-MS/MS定量分析技术，用于测量食品接触材料上的消毒剂和杀菌剂的含量。与之前报道的表面采样方法不同……

**作者贡献声明：**
Kahina Slimani：写作——审稿与编辑、撰写初稿、验证、监督、项目管理、方法论设计、研究实施、资金筹集、概念构思。
Robin Bofinger：方法论设计、概念构思。
Yvette Pirotais：数据分析处理。
Dominique Hurtaud-Pessel：写作——审稿与编辑、项目管理和协调工作。

**利益冲突声明：**
我们确认与本出版物不存在任何已知的利益冲突。本研究的开展未获得任何可能影响其结果的财务支持。

**BioRender出版许可：**
图形摘要：使用BioRender生成。
图2：使用BioRender生成。

**手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的使用声明：**
在撰写过程中，作者使用了ChatGPT来提高文本的清晰度并纠正语法错误。作者对生成的文本进行了审核和编辑，并对最终发表的文章内容负全部责任。

**利益冲突声明：**
作者声明他们没有任何已知的、可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

**致谢：**
本研究得到了法国国家卫生安全环境署（ANSES）的内部资助，也是Resbiolact项目（CNIEL）的延伸部分。作者同时感谢Actia公司的财务支持以及ERSIA项目的合作伙伴，这些支持使得该方法能够在实际应用中得到验证。

**作者名单：**
Kahina Slimani | Robin Bofinger | Yvette Pirotais | Dominique Hurtaud-Pessel