《Frontiers in Plant Science》：Transcriptome analysis identifies candidate genes for southern root-knot nematode resistance in cultivated peach
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根结线虫（Meloidogyne spp.）危害桃树；由于存在其他管理策略，防治需依赖最有效方法之一，而非仅依赖最根本途径。研究人员比较了抗性‘Nemaguard’与感病‘Bailey’在接种南方根结线虫（Meloidogyne incognita）后的根部转
根结线虫（Meloidogyne spp.）危害桃树；由于存在其他管理策略，防治需依赖最有效方法之一，而非仅依赖最根本途径。研究人员比较了抗性‘Nemaguard’与感病‘Bailey’在接种南方根结线虫（Meloidogyne incognita）后的根部转录组。接种后0、3、6、9、12和24 h取样根系。两种基因型均在24 h表现出最强的转录响应。差异表达和基因本体论（Gene Ontology, GO）分析鉴定出14个防御和信号相关候选基因，包括13个抗性（resistance, R）基因和1个信号相关基因。研究人员通过定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）检测了14个候选基因的表达。其表达模式与RNA-seq结果一致。这些候选基因可用于进一步测试其在桃对M. incognita抗性中的作用。
根结线虫（Meloidogyne spp.）在植物中建立取食位点并吸取营养，造成严重作物损失，位居世界十大植物寄生线虫之首。其广泛分布，可侵染3000余种植物，包括果树、蔬菜和大田作物。线虫危害降低水分和养分吸收，并为细菌和真菌病原体提供入口，削弱植物活力和产量。防治主要依赖化学处理，另有物理、生物、栽培和综合措施。在桃上，根结线虫削弱树势、降低果实产量和品质，甚至造成树死亡；南方根结线虫（Meloidogyne incognita）是中国影响桃的主要种。抗性砧木是化学防治的替代。遗传研究已在桃中定位M. incognita抗性基因，包括2号染色体顶端的主效基因及PkMi，以及栽培桃2号染色体92-kb区间内另一抗性基因。转录组分析可通过基因表达变化鉴定候选基因，已在桃蚜虫抗性、果实成熟和花形等研究中应用，但桃线虫抗性相关基因研究较少。因此，研究人员比较抗性‘Nemaguard’和感病‘Bailey’接种M. incognita后不同时间根转录组，以鉴定差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）并筛选候选抗性基因。
关键技术方法概述：以抗性‘Nemaguard’和感病‘Bailey’为材料，样本来自中国农业科学院郑州果树研究所桃园；接种M. incognita后于0、3、6、9、12、24 h取根，每时间点每基因型3个重复，共36个样本；线虫经会阴花纹形态和种特异性PCR鉴定；进行RNA-seq（Illumina NovaSeq 6000，PE150），clean reads用HISAT2比对桃参考基因组Prunus persica genome v2.0；以|log
2(fold change)| ≥ 1且q-value < 0.05定义DEGs；进行GO、KEGG和加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）；用qRT-PCR验证候选基因，以桃Actin为内参，采用2
?ΔΔCT法计算相对表达。
3.1 M. incognita鉴定：雌虫会阴花纹呈梨形，背弓高而方，多数条纹波浪状，侧线不明显，尾区无刻点，与M. incognita描述一致；种特异性引物扩增约500 bp片段，其他五种引物无带。形态和分子结果将桃根瘿线虫鉴定为M. incognita。
3.2 抗性和感病基因型差异基因表达：以FPKM衡量表达，DEG标准为q-value < 0.05且|log
2(fold change)| ≥ 1。‘Nemaguard’五个时间点共9,388个DEGs，数量一般随时间增加；‘Bailey’在3、6、9、12、24 h分别为4,591、5,575、6,592、6,457、8,502个DEGs。抗感比较共获得5,716个DEGs，数量先降后升，24 h最高。
3.3 DEGs的GO富集分析：在‘Nemaguard’中，各时间点分别显著富集37、16、23、28、30个GO术语，多属分子功能和生物过程，涉及胁迫响应、生长、发育和适应；如DNA结合转录因子活性、转录顺式调控区结合、血红素结合、防御响应、氧化还原酶活性等。抗感比较中，富集术语随时间变化，包括质膜、蛋白磷酸化、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、ADP结合、真菌防御响应、创伤响应和细胞缺氧响应等。
3.4 DEGs的KEGG富集分析：‘Nemaguard’五个时间点富集10条代谢通路，谷胱甘肽代谢在每个时间点均富集，6 h DEGs最多；6 h和9 h富集通路范围最宽，12 h最窄。抗感比较富集7条KEGG通路，3 h氨基糖和核苷酸糖代谢最强，植物-病原互作通路DEGs最多；6 h和12 h共有光合作用，9 h和24 h无显著富集。结果表明包括抗性相关基因表达在内的生理生化响应在接种后6 h已活跃。
3.5 WGCNA：去除低表达基因后，18,101个基因用于WGCNA，软阈值12、合并切割高度0.25产生21个模块，最大darkorange含7,573个基因，最小lightpink3含40个，grey含329个未分配基因。darkmagenta模块与‘Nemaguard’接种后3 h样本显著正相关；其基因显著富集于代谢通路、次级代谢物生物合成和α-亚麻酸代谢。
3.6 候选基因选择：‘Nemaguard’中1,392个基因在五个时间点均上调；‘Bailey’中77个基因在五个时间点均上调；两基因型共享57个每个时间点均上调的基因，选择其进一步分析。
3.7 候选基因GO富集分析：57个基因经DAVID分析富集14个术语，生物过程包括次级代谢物生物合成、细胞生物合成、DNA损伤响应、植物型超敏反应和防御响应，其中DNA损伤响应最强，防御响应含DEGs最多；细胞组分中细胞质显著富集且DEGs最多；分子功能包括2-酮戊二酸依赖双加氧酶活性、双加氧酶活性、ADP结合和ATP结合，ADP结合显著富集，ATP结合含DEGs最多。候选基因与M. incognita感染期间植物防御和核苷酸结合相关。
3.8 qRT-PCR验证：基于GO分析和已发表防御相关基因工作，选择14个候选基因，包括Prupe.1G545300、Prupe.1G205400、Prupe.2G126900、Prupe.8G009700、Prupe.2G111800、Prupe.1G545000、Prupe.1G545100、Prupe.4G284800、Prupe.3G016700、Prupe.4G284000、Prupe.8G027000、Prupe.8G120600、Prupe.4G285500和Prupe.4G284300。qRT-PCR显示基因表达变化基本与RNA-seq一致，表明转录组数据可靠性高。
讨论部分总结：抗性基因表达时序因植物基因型而异；在Prunus kansuensis中M. incognita抗性基因在接种后12 h显著上调，kenaf中HcNPR1在72 h达峰，番茄Mi在12 h上调。DEG数量变化也因物种不同。本研究中抗性‘Nemaguard’的DEG数量一般随接种后时间增加，基因型内和间比较富集谷胱甘肽代谢、苯丙素生物合成、淀粉和蔗糖代谢、类胡萝卜素生物合成、植物-病原互作、光合作用-天线蛋白及氨基糖和核苷酸糖代谢等通路。R基因介导多种植物防御，NBS-LRR蛋白是主要R蛋白，其NB域结合GTP、GDP、ATP和ADP，LRR域参与抗性和蛋白互作。植物激素参与调控对线虫防御，番茄中JA活性增强可增强对M. incognita防御，SA参与R基因介导抗性；JA及相关化合物诱导防御信号及黄酮类、萜类等次级代谢物。研究人员鉴定14个候选基因，蛋白序列分析将13个归为R基因，其中7个编码CC-NBS-LRR，2个编码TIR-NBS-LRR，2个编码NBS-LRR，另2个分别编码TIR-NBS和仅LRR蛋白。7个候选同源于拟南芥AT3G14470，2个同源于AT5G36930，其余5个同源物为AT3G54420、AT3G07040、AT3G14460、AT4G27190和AT5G17680。这些拟南芥基因与胁迫和防御有关。Prupe.8G009700编码NBS-LRR样R蛋白，其拟南芥同源AT3G07040（RPM1）参与抗病；Prupe.8G027000与SA信号相关，其拟南芥直系同源物在病原侵入后激活SA信号并调控JA和ET相关防御通路，因此Prupe.8G027000是进一步研究桃抗M. incognita中SA相关信号的候选。
结论翻译：研究人员比较了抗性‘Nemaguard’和感病‘Bailey’接种M. incognita后的根部转录组。GO、KEGG和共表达分析描述了其随时间变化的响应。鉴定出14个候选防御相关基因，包括13个R基因和1个信号相关基因。14个候选基因的qRT-PCR结果与RNA-seq数据一致。这些候选基因可进一步测试，以确定其在桃线虫抗性中的作用。
