靶向TLR4通过调控中枢驻留细胞与Th1/Th17分化减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎进展

《Frontiers in Immunology》：Targeting TLR4 alleviates the progression of experimental autoimmune encephalomyelitis by regulating central resident cells and Th1/Th17 cell differentiation

　　

： 多发性硬化（MS）是一种以神经炎症为特征的自身免疫性脱髓鞘疾病。Toll样受体4（TLR4）是损伤相关分子模式（如高迁移率族蛋白B1，HMGB1）的受体，在固有免疫中发挥作用。然而，其在MS发病机制中的确切作用及细胞动态尚不清楚。研究人员利用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型，绘制了TLR4的表达动态图谱，发现在脊髓中，与疾病相关的细胞类型从神经元转变为活化的胶质细胞。为建立因果关系，研究人员将TLR4-/-小鼠诱导EAE，观察到疾病严重程度显著减轻、脱髓鞘减少、神经元完整性得以保留，同时小胶质细胞和星形胶质细胞活化受到抑制。此外，TLR4缺失不仅抑制了中枢神经系统（CNS）局部的炎症，还与外周MOG35–55特异性Th1/Th17效应反应的抑制相关，表现为淋巴器官中IFN-γ和IL-17A产生减少，TNF-α降低，以及脊髓浸润中Th1/Th17谱系定义转录因子T-bet和RORγt表达减弱。这表明TLR4通过连接外周Th1/Th17分化与中枢胶质炎症反应，在EAE病理中发挥关键作用。关键的是，为转化这些发现，研究人员评估了小分子TLR4拮抗剂TAK-242。虽然预防性给药有效，但疾病发病后启动的治疗性给药仍能显著减轻临床评分并延缓疾病进展，凸显了其临床干预潜力。总体而言，研究结果表明，靶向TLR4可同时抑制致病性T细胞分化和局部神经炎症，确立TLR4作为MS双重作用的治疗靶点。

论文解读文章：

一、研究背景与科学问题

多发性硬化（MS）是一种累及中枢神经系统（CNS）的慢性炎症性脱髓鞘疾病，全球超过230万人受累，造成沉重的社会经济负担。尽管现有免疫调节疗法（如干扰素（IFN）-β、糖皮质激素、芬戈莫德及单克隆抗体）可降低复发率并改善生活质量，但常伴随严重不良反应。MS的病理特征包括炎症、胶质增生、轴突变性及脑和脊髓髓鞘脱失，导致进行性神经功能障碍。血脑屏障（BBB）破坏是关键始动事件，允许髓鞘反应性T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞等外周免疫细胞浸润CNS，驱动自我延续的神经炎症级联反应。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是MS的主要实验模型。鉴于现有疗法局限性，寻找驱动这一神经炎症轴的关键分子靶点成为迫切需求。

高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是一种核蛋白，作为损伤相关分子模式（DAMP）在EAE/MS发病中发挥重要作用。炎症条件下，HMGB1被刺激的免疫和非免疫细胞主动分泌，或从受损/坏死神经元和胶质细胞被动释放。细胞外HMGB1通过Toll样受体2（TLR2）、TLR4及晚期糖基化终末产物受体（RAGE）等受体信号传导，诱导促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和趋化因子产生，放大免疫细胞募集和活化。值得注意的是，TNF-α等促炎因子可进一步刺激HMGB1从神经元转位释放，形成致病性正反馈环路。MS患者脑脊液（CSF）和血清中HMGB1及可溶性TLR4水平与疾病活动度和预后相关。TLR4作为HMGB1的主要受体，在帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）和亨廷顿病（HD）等多种神经退行性疾病中发挥作用。已有研究表明TLR4通过CCL25/CCR9信号通路介导EAE中Th17细胞浸润，LPS等TLR4配体处理可加重EAE，而TLR4靶向破坏可阻止疾病发展。TAK-242（Resatorvid/CLI-095）是一种外源性合成小分子TLR4拮抗剂，可穿越BBB，在脑缺血模型中显示神经保护作用，通过结合受体TIR结构域，干扰TLR4与衔接分子的相互作用，抑制下游信号。然而，TLR4抑制在EAE驱动的神经炎症中的精确机制和完整治疗潜力仍需阐明。

因此，本研究旨在探讨EAE进展过程中脊髓TLR4的表达、细胞分布和功能作用，并验证使用TAK-242药理学抑制HMGB1/TLR4轴可通过调节致病性Th1/Th17反应和保护神经元完整性来减轻EAE严重程度，从而确认TLR4作为MS等神经炎症性疾病的可成药治疗靶点。

二、研究内容与主要结论

研究人员首先通过免疫组化和免疫荧光双标记技术，系统描绘了EAE小鼠脊髓中TLR4和HMGB1的表达动态及细胞分布变化。结果显示，与 na?ve 小鼠相比，EAE小鼠脊髓白质和灰质中HMGB1和TLR4阳性细胞数量显著增加，且两者表达呈正相关并共定位。在细胞类型层面，na?ve小鼠脊髓中TLR4表达于神经元（NeuN阳性）、小胶质细胞（Iba1阳性）和星形胶质细胞（GFAP阳性）；而在EAE高峰期，TLR4在神经元上的表达显著减弱，转而主要表达于活化的小胶质细胞和星形胶质细胞，提示神经炎症条件下TLR4表达发生神经元向胶质细胞的细胞类型特异性转变。

为建立因果关系，研究人员对TLR4基因敲除（TLR4^-/-）小鼠诱导EAE。与野生型（WT）小鼠相比，TLR4^-/-小鼠EAE发病率降低（78% vs 100%），平均最大临床评分降低约三倍（1.08 ± 0.23 vs 3.08 ± 0.11），疾病 onset 显著延迟（13.64 ± 0.93天 vs 11.00 ± 0.14天）。病理学检查显示，TLR4缺失显著减轻脊髓脱髓鞘（LFB染色评分降低）和炎症细胞浸润（H&E染色），特别是CD3阳性T淋巴细胞浸润减少。ELISA检测显示，EAE高峰期TLR4^-/-小鼠血清和脊髓匀浆中TNF-α、IFN-γ和IL-6水平显著降低，而IL-17A无显著差异。免疫组化分析表明，TLR4缺失抑制了EAE诱导的小胶质细胞（Iba1阳性）和星形胶质细胞（GFAP阳性）活化，并显著增加了灰质中存活神经元（NeuN阳性）数量，保护了神经元完整性。

在外周免疫反应层面，研究人员收集EAE高峰期（第19天）脾脏和引流淋巴结（DLN）细胞，经MOG_35–55肽再刺激72小时后ELISA检测细胞因子。结果显示，与WT EAE小鼠相比，TLR4^-/- EAE小鼠脾脏和DLN细胞中IFN-γ和IL-17A产生显著减少，TNF-α在未刺激和再刺激培养中均降低，提示TLR4缺失抑制了MOG特异性Th1/Th17效应反应。在CNS局部，RT-qPCR分析显示，TLR4缺失逆转了EAE诱导的脊髓中TNF-α、IFN-γ、IL-17A以及Th1/Th17谱系定义转录因子T-bet和RORγt的mRNA表达上调。

为验证药理学干预可行性，研究人员采用三种给药策略评估TAK-242（25 mg/kg，腹腔注射，隔日一次）的效果：策略I（预防性给药，第-1至29天）、策略II（中期给药，第11至21天）和策略III（晚期给药，第15至23天）。结果显示，预防性给药最为有效，显著降低EAE发病率（59% vs 100%）、延迟发病（15.00 ± 0.70天 vs 11.50 ± 0.17天）并降低最大临床评分（1.57 ± 0.43 vs 2.95 ± 0.16），且提供长期保护。中期和晚期治疗性给药同样显著减轻疾病严重程度（最大评分分别降至1.63 ± 0.26和2.38 ± 0.16），表明即使在疾病 onset 后启动治疗，TLR4抑制仍能有效控制疾病进展。

三、主要技术方法

本研究采用以下关键技术方法：使用雌性C57BL/6J野生型（WT）小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）和TLR4基因敲除（TLR4^-/-）小鼠（购自南京大学模式动物研究所，在C57BL/6J背景下繁殖12代）；通过MOG_35–55肽皮下免疫联合完全弗氏佐剂（CFA）和百日咳毒素腹腔注射诱导EAE模型，并按0-5分标准每日评估临床评分；采用免疫组织化学（IHC）和免疫荧光双标记染色结合激光共聚焦显微镜分析脊髓组织中TLR4、HMGB1、Iba1、GFAP、NeuN和CD3的表达与细胞分布；使用Luxol Fast Blue（LFB）染色评估脱髓鞘程度，苏木精-伊红（H&E）染色评估炎症浸润；通过RT-qPCR检测脊髓组织中TNF-α、IFN-γ、IL-17A、T-bet和RORγt的mRNA表达；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清、脊髓匀浆及脾脏和DLN细胞培养上清中TNF-α、IFN-γ和IL-17A的蛋白水平。

四、讨论与结论

本研究的核心发现是TLR4在EAE发展中发挥关键作用。研究证实，TLR4信号通路激活促进EAE中的神经炎症、脱髓鞘和神经元损伤；反之，通过基因敲除或药理学阻断抑制该通路可显著减轻疾病严重程度。机制上，TLR4缺失不仅抑制了CNS局部小胶质细胞和星形胶质细胞的病理性活化，减少了促炎细胞因子产生，还抑制了外周和中枢的致病性Th1/Th17分化及效应功能，同时保护了神经元存活。TLR4在EAE中从静息状态下的“监视受体”转变为驱动病理性神经炎症的“活跃参与者”，其表达从神经元向胶质细胞的转变标志着这一功能转换。

值得注意的是，TLR4在EAE中的作用存在争议。Monica Marta等人报道TLR4/TLR9在EAE中发挥调节作用，而Miranda-Hernandez等人认为EAE主要依赖MyD88/TLR2/TLR9，TLR4不起实质作用。然而，早在2004年Steven M Kerfoot等人即报道TLR4^-/-小鼠EAE严重程度低于WT小鼠。这些差异可能源于小鼠品系、免疫方案、佐剂和疾病阶段的不同。在本研究标准化的MOG_35–55诱导C57BL/6J EAE模型中，TLR4基因缺失和TAK-242药理学抑制均一致减轻疾病严重程度，支持TLR4在此模型中发挥促炎作用。

从临床转化角度看，MS病变组织中同样显示TLR4及其配体HMGB1表达升高。TAK-242的安全性已在脓毒症临床试验中得到验证，为其重定位用于神经免疫疾病治疗提供了便利。未来需进一步研究TLR4抑制剂与现有MS疾病修饰疗法（如干扰素、芬戈莫德和CD20单克隆抗体）的联合效应，以及在不同MS亚型（如复发缓解型和进展型）动物模型中的疗效。

本研究也存在局限性：首先，TLR4全身性敲除无法区分其在造血系统（免疫细胞）与非造血系统（CNS驻留细胞）中的相对贡献，特别是神经元与胶质细胞TLR4的相对作用，未来需借助骨髓嵌合体、细胞特异性条件敲除小鼠或神经元靶向病毒方法加以明确。其次，研究主要聚焦Th1/Th17反应，TLR4对调节性T细胞（Tregs）功能及其他免疫细胞亚群的影响尚待探索。第三，仅检测了有限的血清细胞因子，未检测血清IL-1β和IL-10，且无法定量CNS局部细胞因子。第四，未评估抗原特异性增殖，且 bulk 培养增殖读数无法区分T细胞内源性效应与抗原提呈细胞（APC）介导的效应，结论仅限于效应细胞因子产生。第五，TAK-242在CNS中的具体剂量、药代动力学和分布浓度需进一步优化和阐明。

综上所述，本研究提供了多层次证据链，确认TLR4信号通路在EAE神经炎症的启动、放大和神经元损伤中介导中的核心作用。通过基因敲除或小分子抑制剂TAK-242抑制TLR4，可有效减轻疾病严重程度，涉及抑制固有免疫细胞活化、减少促炎细胞因子产生、减弱致病性Th1/Th17反应和保护神经元存活。这些发现加深了对EAE/MS发病分子机制的理解，为开发靶向TLR4的新型免疫调节疗法提供了坚实的临床前基础。