《Frontiers in Immunology》：Haplotype-resolved swine leukocyte antigen (SLA) gene typing using long-read whole genome sequencing
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背景：主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC）是存在于所有脊椎动物中的基因组区域，编码免疫应答所必需的基因。在猪中，MHC被称为猪白细胞抗原（Swine Leukocyte Antigen, SLA）复
背景：主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC）是存在于所有脊椎动物中的基因组区域，编码免疫应答所必需的基因。在猪中，MHC被称为猪白细胞抗原（Swine Leukocyte Antigen, SLA）复合体。传统SLA基因分型方法依赖SLA基因的靶向扩增和测序。本研究中，研究人员评估了能否从非靶向Oxford Nanopore长读长测序数据中识别SLA基因，以创建一种可应用于现有长读长测序数据集的通用方法。
方法：研究人员分析了来自四个品种（Large White、Duroc、Landrace以及Large White来源合成系）的56头猪，并通过定相和haplotagging生成了分离为单倍型的从头基因组组装。将IPD-MHC数据库中的SLA基因序列比对到单倍型解析的组装，并使用靶向NGS的SLA分型评估候选新等位基因和单倍型。
结果：该方法能够为超过95%的SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-DRB1和SLA-DQB1基因实现可信的等位基因指定。多数结果由先前已报道的单倍型组成，并额外包括若干潜在新等位基因和单倍型。靶向NGS的SLA分型证实了七个新class I单倍型以及三个新SLA-2等位基因的存在，尽管其中两个仍需额外测序以完全解析其外显子2序列。研究人员还观察到组装来源的SLA单倍型与SLA区域内中密度基因型之间存在强连锁，支持在具有相似连锁不平衡结构的群体中高效识别和监测SLA多样性。
结论：现有长读长测序和基因型数据集可用于表征SLA变异、鉴定候选新单倍型和等位基因，并为研究所涉及猪群体内SLA多样性提供见解。
主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC；编码抗原提呈和免疫识别相关分子的基因组区域）存在于所有脊椎动物中，在适应性免疫中发挥核心作用。在猪中，MHC被称为猪白细胞抗原（Swine Leukocyte Antigen, SLA）复合体，位于7号染色体并跨越着丝粒。SLA class I区域包含高度多态的经典功能基因SLA-1、SLA-2和SLA-3，以及若干非经典和假SLA基因；class II区域包含SLA-DQ、SLA-DR、SLA-DM和SLA-DO基因。MHC分子通过肽结合槽结合抗原并提呈于抗原提呈细胞表面，其肽结合槽由class I基因外显子2和3或class II基因外显子2编码，氨基酸组成决定可结合的肽库，从而影响免疫应答。SLA基因高度多态，传统分型依赖靶向扩增和测序，如PCR-SSP、PCR-RFLP、SBT、GSBT和基于NGS的分型。问题在于，这些方法通常需要额外靶向实验，难以直接利用已有非靶向长读长全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）和中密度SNP芯片数据。研究人员因此评估能否从已有Oxford Nanopore（ONT）长读长WGS数据中识别SLA基因，构建单倍型解析参考框架，并利用中密度SNP基因型推断SLA单倍型，验证候选新等位基因和单倍型，进而了解研究所涉及猪群体的SLA多样性。
关键技术与方法概括：样本队列包括56头猪，来自Large White、Landrace、Duroc、Large White来源合成系以及Landrace×Large White F1，长读长测序数据于2022—2025年产生，血样来自育种项目常规采样；靶向验证另包括32头Synthetic×Landrace×Large White动物及6头追加动物，共38头。主要技术为ONT PromethION长读长WGS；Flye和NextDenovo进行从头组装；minimap2比对；HapDup或Clair3变异检测结合Whatshap定相和haplotagging，并用Flye重组装SLA区域以获得单倍型解析序列；将IPD-MHC数据库等位基因序列映射至组装并确定最佳匹配；利用Illumina SNP芯片基因型进行定相和SNP单倍型构建；通过靶向Illumina NGS进行SLA class I分型验证。
结果部分，在“De novo genome assembly and local haplotype-resolving（从头基因组组装与局部单倍型解析）”中，研究人员对56头猪的ONT长读长数据进行单倍体从头组装，纯种样本contig N
50平均为64—70 Mb，杂交动物平均为34 Mb。将IPD-MHC等位基因序列映射至组装后，12个样本的所有等位基因映射到单一contig，多数样本class I和class II等位基因映射到不同contig，可能与着丝粒难以解析有关；两个样本的等位基因映射到三个contig，第三个contig仅含SLA假基因。由于初始组装混合两个单倍型，研究人员进一步采用HapDup分离SLA区单倍型，但14个样本存在局部单倍型塌缩；随后以Clair3进行变异检测，结合Whatshap定相和haplotagging，并分别组装SLA class I和class II区域，虽更碎片化，但解决了部分HapDup未分离的单倍型。
在“SLA allele typing of haplotype-resolved assemblies（单倍型解析组装的SLA等位基因分型）”中，研究人员将IPD-MHC数据库所有SLA等位基因编码序列映射至单倍型分离组装，依据外显子2和3序列与最佳匹配等位基因的一致性进行分类。经插入缺失校正后，约95%的基因与数据库等位基因完全匹配；共发现8例SLA-1基因重复，合计120个SLA-1等位基因。该结果表明基于长读长组装的方法可实现较准确的SLA基因识别。
在“Identifying novel alleles for SLA-2（鉴定SLA-2新等位基因）”中，研究人员发现两个潜在新SLA-2等位基因。三个动物相对SLA-2*07:03在外显子2存在5个错配，外显子3与SLA-2*07:03相同，错配均导致氨基酸改变，其中4个氨基酸变化见于其他07:*等位基因，1个见于02:*和04:*。另五个动物相对SLA-2*06:01在外显子3存在4个错配，外显子2与SLA-2*06:01、SLA-2*06:07和SLA-2*06:16相同，错配导致2个氨基酸改变，均见于其他06:*等位基因。靶向测序验证显示，类似SLA-2*06:01的候选新等位基因与长读长组装序列完全一致；类似SLA-2*07:03的候选新等位基因有两个核苷酸差异位于靶向测序未覆盖的外显子2前87 bp，其余三个差异一致，因此确认存在新等位基因，但完整外显子2序列尚需额外测序。
在“Identifying known and potential novel SLA haplotypes（鉴定已知和潜在新SLA单倍型）”中，研究人员将共遗传的连锁SLA等位基因组定义为SLA单倍型。class I单倍型包括SLA-1、SLA-2、SLA-3，并可包括SLA-6；class II单倍型包括SLA-DRB1、SLA-DQB1，并可包括SLA-DQA和SLA-DRA。由于无法跨class I和class II可信解析亲本定相，研究人员将两类分开考虑。
在“Phasing & copy number variation（定相与拷贝数变异）”中，研究人员比较单倍型结果与文献已知单倍型及群体内其他动物，发现6例疑似SLA-1与SLA-3之间定相错误，表现为动物携带已知单倍型但SLA-1等位基因在单倍型间交换。拷贝数变异（copy number variation, CNV）可能解释该现象。自比对、读深和变异密度分析显示，两例预期对应Hp-28的样本理论上有11个SLA基因或假基因拷贝，组装中仅显示8个拷贝；在SLA-1两个拷贝之间出现覆盖度大幅降低和缺乏变异检出，可能为一条单倍型存在而另一条缺失的重复片段，导致无法可靠定相。其他疑似样本也显示额外基因拷贝、无变异区和覆盖峰。研究人员认为重建单倍型与已知单倍型对应，且CNV相关定相限制支持这些为定相错误而非真实独立重组，因此后续采用重建单倍型。
在“Class I haplotypes（class I单倍型）”中，排除4个含未解析等位基因的单倍型后，剩余108个组成22种不同class I单倍型，其中16种为先前文献描述。研究人员鉴定出6种潜在新class I单倍型，其中New1和New2携带新SLA-2等位基因07:Novel和06:Novel；New3的SLA-1重复此前已描述但未分配到完整单倍型；New4、New5和New6可能与群体内重组事件有关。Hp-55.0在该群体中频率最高，在Large White中观察到，但Landrace中频率最高；Hp-1.0、Hp-4a.0、Hp-4b.0、Hp-25.0和Hp-32.0也较常见。
在“Class II haplotypes（class II单倍型）”中，研究人员鉴定出19种不同class II单倍型，未发现类似class I的单一高频单倍型。Hp-0.2、Hp-0.6和Hp-0.12b各出现14次；Hp-0.2仅在Duroc中发现，Hp-0.6和Hp-0.12b在Landrace中更常见，与既往研究一致。标记为“NA”的单倍型此前已描述，但无官方名称。
在“SNP-based haplotypes（基于SNP的单倍型）”中，研究人员使用23个class I区SNP和9个class II区SNP构建SNP单倍型，并评估其与SLA单倍型的共现。class I中17种SLA单倍型仅对应单一独特SNP单倍型，5种对应多个独特SNP单倍型，仅SLA单倍型32.0和73.0共享同一SNP单倍型而无法区分；class II中15种对应单一独特SNP单倍型，4种对应多个独特SNP单倍型，且无SLA单倍型共享同一SNP单倍型。结果表明SNP单倍型与SLA单倍型强连锁，6种潜在新单倍型可与该数据集中其他单倍型区分。研究人员进一步确定class I和class II SLA单倍型是否属于同一亲本单倍型，发现两类间连锁较低，共53种不同组合，其中13种出现超过两次，最常见Hp-55.6出现9次，与高度近交Babraham猪中的单倍型相同。
在“Validating SNP-based SLA inference with targeted NGS-based typing results（用靶向NGS分型验证基于SNP的SLA推断）”中，研究人员使用32头F2动物（Synthetic×Landrace×Large White）的SNP芯片和靶向NGS class I分型结果，并加入6头用于验证候选新SLA-2等位基因的动物，共构建76种SNP单倍型，其中54种存在于长读长测序群体。基于SNP单倍型的推断均与靶向NGS分型一致。SNP单倍型H35对应SLA单倍型08:10、12:01、06:01，此前被描述为Hp-22。
在“Identification of additional novel SLA-2 allele（鉴定额外新SLA-2等位基因）”中，与SNP单倍型H8和H28连锁的SLA单倍型疑似携带新SLA-2等位基因。对P25—P32样本的靶向测序结果发现，两种单倍型共享一个单一新SLA-2等位基因，该等位基因与SLA-2*06:12具有99%同一性，7个碱基错配导致2个氨基酸改变。加入携带该新等位基因的单个长读长样本后，错配与靶向测序结果一致，但长读长序列在外显子2起始有两个额外碱基错配，导致两个额外氨基酸改变，因此仍需覆盖完整外显子2的靶向测序确认完整序列。
在“Overview of novel haplotypes（新单倍型概览）”中，研究人员推断SNP单倍型H9、H51和H137对应SLA-1*21:03/SLA-2*06:04/SLA-3*04:XX的组合，该组合此前未见文献描述。靶向测序还揭示两个共享新SLA-2等位基因的新单倍型，并确认最初由长读长测序鉴定的New1、New2、New3和New6。合计经靶向测序确认7种新class I单倍型，其中包括3个新SLA-2等位基因序列。
讨论部分总结：研究人员探索利用已有基因组数据集表征SLA等位基因和单倍型的可行性。将IPD-MHC数据库SLA等位基因比对到ONT长读长WGS构建的局部单倍型解析组装，可为多数动物识别SLA等位基因和单倍型；将组装来源SLA单倍型与中密度SNP芯片基因型关联，可评估从常规基因型数据推断SLA单倍型的潜力。该方法可充分利用已有长读长WGS数据，支持大规模SLA多样性研究，但数据质量与定相准确性影响结果。准确定相的关键困难包括SLA class I区CNV和假基因导致读段比对、变异检测和定相复杂化。研究人员采用两套独立流程识别并校正方法特异错误；HapDup整体表现较好，但其变异检测器PEPPER在某些区域失败；Clair3更适合该区域但后续Flye组装较碎片化。6例疑似定相错误提示结构复杂区域单倍型分配需谨慎。尽管如此，多数样本无明显定相问题，单倍型解析组装可发现候选新等位基因，且长读长推断序列与靶向测序一致。SNP单倍型与SLA单倍型强连锁，并在独立靶向NGS数据集中得到验证，显示其可作为高效预测方法，但跨群体可移植性受单倍型多样性、等位基因频率和历史重组影响，需在更多遗传背景和本地猪群体中验证。研究人员强调，该方法不是替代既有SLA分型方法，而是补充现有SLA研究；随着更多高质量长读长数据出现，可更全面编目SLA等位基因和单倍型，包括当前IPD-MHC数据库中缺失的罕见和候选新变异。若得到验证，基于SNP的方法可为群体尺度监测SLA多样性提供更易获得且成本更低的手段，有助于维持猪群体足够遗传多样性。
研究结论翻译：现有长读长测序和基因型数据集可用于表征SLA变异，鉴定候选新单倍型和等位基因，并为研究所涉及猪群体内SLA多样性提供见解。
