《Current Atherosclerosis Reports》：In-vivo CRISPR/Base-Editing “One-Shot” Therapies Targeting PCSK9
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综述目的：评估并呈现基因编辑用于降低动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）的当前状态，重点关注靶向前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）基因编辑的技术与在研临床试验。
近期发现：目前有两项在人体中开展的在研临床试验，利用封装于脂质纳米颗粒（LN
综述目的：评估并呈现基因编辑用于降低动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）的当前状态，重点关注靶向前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）基因编辑的技术与在研临床试验。
近期发现：目前有两项在人体中开展的在研临床试验，利用封装于脂质纳米颗粒（LNPs）中的CRISPR-Cas9碱基编辑技术编辑PCSK9基因。初步的中期及临床前数据表明，该策略在单次静脉输注后能够有效实现PCSK9和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的长期降低。
总结：中和循环中PCSK9的单克隆抗体已证实抑制PCSK9在降低LDL-C和ASCVD方面的效用。尽管目前抑制PCSK9的药物策略日益增多，基因编辑因其有望永久性降低循环PCSK9水平，进而降低LDL-C和ASCVD，成为一种颇具吸引力的选择。目前有两项在人体中开展的在研临床试验正在考察PCSK9基因编辑的安全性和有效性，初步结果令人鼓舞。本综述将阐述PCSK9作为治疗靶点的背景、基因编辑机制及初步结果。研究人员还探讨了该技术独特的安全性挑战，并提出了在诸多未知因素下选择合适患者群体以维持净获益的考量建议。
论文主体内容总结
引言
动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是发达国家的主要死亡原因，而低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高是其发生和进展的主要危险因素。目前已有多种经证实可降低LDL-C及心血管病发病率和死亡率的疗法，这些药物靶向LDL-C合成、吸收或清除的相关机制，涵盖小分子药物、单克隆抗体和干扰RNA等多种药物形式。然而，对部分患者而言，现有方案仍难以实现LDL-C的最佳控制。基因编辑策略正作为实现终身LDL-C降低的“一次性”选择崭露头角，相关临床试验正在进行中。
PCSK9的分子生物学与药理学
前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）在多种组织中合成并分泌入血清，其中肝脏是循环PCSK9蛋白的主要来源。PCSK9在脂质生物学中的重要性源于对极低LDL水平人群的研究，PCSK9失活型基因变异被证实可剂量依赖性地降低LDL-C及ASCVD风险。循环中的PCSK9通过增加肝细胞LDL受体（LDLR）的周转率并缩短其功能半衰期，降低LDLR表达，从而减少LDL颗粒的清除。
PCSK9已成为降LDL-C的重要药物靶点，中和性单克隆抗体是最常用的方式。目前有两种FDA批准的抗体类药物，alirocumab和evolocumab，即使在他汀背景治疗下也可使血清LDL降低60–70%，并降低二级预防患者及高风险一级预防患者的ASCVD风险。此外，长效干扰RNA技术inclisiran可每6个月皮下注射一次，使LDL-C降低约40–50%。新型抗体模拟物lerodalcibep-liga（adnectin类）已上市，为每月一次注射。口服生物可利用抑制剂也展现出疗效，首创的大环肽类抑制剂enlicitide decanoate可使LDL-C降低57.1%。口服小分子PCSK9抑制剂也在进行有效性试验。
近期证据提示PCSK9还存在肝外和细胞内作用，可能涉及炎症、病毒免疫和细胞内应激反应。在考量各类新兴PCSK9抑制方案的疗效和不良反应时，需考虑各药物所靶向的PCSK9分布区域，即循环池（单克隆抗体）或肝脏细胞内及分泌池（siRNA）等。
CRISPR-Cas9基因编辑技术概述
CRISPR-Cas9技术可选择性靶向基因组中的特定序列，实现DNA蓝图的永久性消除或修饰。其最简单的形式由两部分组成：与靶DNA序列互补的向导RNA（gRNA）和可实现基因组定位与编辑的Cas9酶。
人体体细胞核含约60亿碱基对DNA，Cas9核糖核蛋白（RNP）需精确定位至仅一个或两个20-bp区域。靶向通过识别短DNA序列——原型间隔区相邻基序（PAMs）启动。PAM弱结合后，Cas9使基因组DNA暴露于sgRNA形成稳定的RNA:DNA杂交螺旋，随后DNA双链被核酸酶结构域切割产生双链断裂（DSB），由内源性非同源末端连接（NHEJ）修复机制以易错方式修复，最终导致随机序列的插入和缺失。
碱基编辑是替代DSB策略的常用方案，旨在提高CRISPR-Cas9系统的保真度和可重复性。腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）因高效和高保真性最为常用。碱基编辑中，Cas9的一个DNA切割结构域被失活，仅产生单链切口。ABE将游离链上的腺嘌呤转化为肌苷，后者在修复、复制或转录过程中被读取为鸟嘌呤。ABE在称为编辑窗口的特定区域内效率最高，窗口内的非预期编辑称为旁观者突变。理想的治疗靶点应在编辑窗口内仅含一个腺嘌呤以确保编辑的均一性。
许多治疗性基因消除策略靶向蛋白编码区或剪接位点，导致提前终止蛋白翻译和基因失活。靶向剪接供体或受体位点导致内含子保留，通常产生提前终止密码子，触发无义介导的mRNA降解途径，使截短蛋白产量可忽略不计。
编辑机制的递送
血清LDL-C水平很大程度上由肝脏的合成与清除稳态决定，因此多数降LDL-C疗法靶向肝脏表达或合成的蛋白。肝脏因清除循环脂蛋白的生理功能而能高效摄取化学工程化的脂质纳米颗粒（LNPs）。目前这些LNPs通过单次静脉输注给药。
LNP表面包被聚乙二醇化和阳离子脂质混合物，负载与靶基因组序列互补的gRNA以及编码Cas9-ABE酶的信使RNA（mRNA）。输注后，颗粒表面被血清蛋白（尤其是ApoE）包被，通过受体介导的内吞进入肝脏并将载荷释放至肝细胞胞质。mRNA被核糖体翻译为Cas9-ABE酶，与共递送的sgRNA结合形成功能性全酶，经内源性机制转运入核，在核内扫描染色质寻找与gRNA互补的序列，实现治疗性基因编辑。
LNP经受体介导的内吞进入肝脏，该过程高度依赖LDL受体。由于纯合家族性高胆固醇血症（HoFH）患者缺乏LDL受体，可能存在摄取不足的问题。为此，研究者将N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）共价连接至脂质层表面。肝脏富含去唾液酸糖蛋白受体，可独立于LDL受体选择性介导GalNAc包被LNP进入肝细胞。
PCSK9基因编辑
PCSK9的生物学特征使其成为体内基因治疗的理想靶点：PCSK9主要在肝脏高表达并分泌入循环；基于PCSK9种系缺失患者的人类遗传学研究，PCSK9缺失似乎无不良影响；PCSK9抑制剂在大型安慰剂对照试验中已证实可有效降低LDL-C和ASCVD风险；基因治疗的前期成本可与终身药物抑制的费用相平衡。
临床前研究在人类原代肝细胞、小鼠和猴子中验证了该概念和技术。Musunuru等人利用腺嘌呤碱基编辑器突变PCSK9外显子1和2之间的mRNA剪接供体位点，导致内含子保留和移码无义转录本。Lee等人在野生型猴中的研究显示，高剂量组（1.5 mg/kg）肝脏PCSK9敲低83%，血清LDL-C降低69%；低剂量组（0.75 mg/kg）分别降低67%和49%。单次输注后这些降低持续超过一年。编辑主要发生在肝脏，但高剂量下肾上腺和脾脏也检测到编辑。未检测到精子或子代中的编辑，脑中也未检测到。输注后猴出现短暂但显著的AST和ALT升高，但迅速恢复正常。
基于这些临床前结果，Verve Therapeutics将该技术商业化并命名为VERVE-101，启动了“Heart-1”试验。该试验纳入合并ASCVD且未积极接受PCSK9抑制剂治疗的杂合FH患者，LDL-C降低幅度为39–55%。一名参与者出现无症状3级转氨酶升高和血小板减少症。一名参与者在输注后5周发生心脏骤停（被认为与治疗无关），另一名发生心肌梗死（被认为可能与治疗相关）。
Verve随后暂停VERVE-101试验招募，将全部精力转向VERVE-102试验。VERVE-102采用GalNAc偶联脂质以促进不依赖LDLR的摄取，并采用新型可离子化和聚乙二醇化脂质以降低炎症反应。VERVE-102的1b期试验纳入杂合FH或早发冠心病患者。最新同行评审中期数据显示，35名参与者接受0.3至1.0 mg/kg总RNA的单次给药。安全性方面，20%患者出现1级或2级输注反应，均无需终止输注；观察到短暂转氨酶升高。有效性方面，循环PCSK9水平呈剂量依赖性降低，在最长545天的随访中多数剂量组效果持久。最高剂量组28天平均LDL-C为51 mg/dl。
YolTech Therapeutics（中国）也在开展PCSK9基因编辑器YOLT-101的研究，采用类似的GalNAc包被LNP，但碱基编辑器为源自Hafnia paralvei的新型序列。该研究仅纳入家族性高胆固醇血症患者。6名参与者的同行评审中期数据显示无严重不良事件，最高剂量（0.6 mg/kg）单次输注使循环PCSK9和LDL-C分别降低74%和52%。
潜在风险与安全性考量
通过基因编辑降低血清PCSK9水平在人类中技术上可行。CRISPR-Cas9机制的表达因mRNA和蛋白半衰期有限而呈瞬时性，但基因组编辑效应将持续患者终生，这一永久性同时适用于靶向编辑和脱靶编辑。腺嘌呤碱基编辑在临床前和临床试验中展现出令人印象深刻的靶向效率，但本质上是一种无法完全控制的致突变工具。偶发脱靶编辑在大型动物模型中尚未被充分评估，主要原因是即使在高温量测序技术下，检测大细胞群体中罕见独特突变仍存在技术局限。
肝脏含有数亿个细胞，LNP治疗将以极高的靶向效率编辑这些细胞。然而，即使考虑低水平脱靶、异质性突变率，部分细胞可能获得向致癌转化方向的第一次或第二次打击。对于接受基因编辑的健康年轻患者，若日后出现脂肪肝、酗酒或病毒性肝炎等导致慢性肝损伤和克隆性再生的危险因素，大量携带随机体细胞变异的细胞可能暴露于促癌选择压力。因此，肝脏致癌风险可能需要数年或数十年才能完全显现。
急性风险包括输注反应、急性肝损伤或转氨酶升高、血小板减少症和动脉粥样硬化斑块不稳定性。目前输注反应轻微且易于处理。急性肝损伤表现为严重转氨酶升高，呈自限性过程。VERVE-101试验中观察到血小板减少症。一名VERVE-101治疗患者在输注后不久发生心肌梗死，可能与治疗相关，也可能与FH人群本身的高心肌梗死和斑块破裂风险相关。
Verve报告编辑效率似乎与总RNA剂量而非体重剂量更相关。一种可能的解释是LNP向非靶组织的分散，这些替代性药物汇可能在到达肝脏前发生摄取、隔离或裂解，且与总体重相关性差。更高总剂量可确保这些位点饱和，使所有个体肝脏获得更高靶向编辑效率。
临床应用
PCSK9基因编辑具有若干潜在治疗优势，最显著的是持久性、治疗负担和有效性。这些优势对年轻、高终身ASCVD风险的一级预防患者最具吸引力，包括具有多种传统ASCVD危险因素、强心血管病家族史、持续性中度血脂异常及LDL-C水平非极端的杂合FH患者。对这些个体，一次性PCSK9基因编辑治疗有望替代数十年的每日或定期药物治疗。然而，这要求PCSK9基因编辑的风险（包括长期危害）被证明极低，因为这些个体短期ASCVD风险较低。
对接受二级预防的老年患者，主要优势在于改善治疗依从性。目前，心肌梗死后两年内坚持降脂治疗的老年患者不足50%，且短期复发性ASCVD事件风险仍较高。前期成本在可预见的未来仍将是问题。
在家族性高胆固醇血症患者中，高强度他汀或PCSK9抑制剂单药治疗往往不足以达到LDL-C<70 mg/dL的最佳水平，PCSK9基因编辑无法消除额外终身降脂治疗的需求。纯合FH患者治疗负担可能相当沉重，包括繁重的LDL血浆置换治疗。然而，PCSK9修饰疗法在纯合FH患者中总体效果较差，LDL受体无效突变者LDL-C无变化。此类患者可接受作用不依赖LDL受体的ANGPTL3抑制剂治疗。与PCSK9基因编辑试验并行，ANGPTL3也在被研究用于基因编辑，近期已发表令人鼓舞的结果。未来可能通过在同一LNP中包含两种sgRNA实现多靶点共编辑。
结论
CRISPR-Cas9技术应用于永久性、组织特异性基因编辑是基因治疗领域的令人振奋的进展。早期同行评审临床结果显示在降低PCSK9和LDL-C方面具有良好的靶向疗效。将这些基因编辑载体视为可定制的肝脏编辑平台，可考虑编辑其他降脂靶点甚至在一次输注中实现多靶点联合编辑。然而，急性不良事件的可能性仍是关切，其风险规模需在更大队列中进一步研究。潜伏性不良结局（如致癌性和肝硬化或非靶组织效应）尚属未知，需在纵向试验中监测。因此，当前临床研究应聚焦于短期ASCVD风险最高的患者。此外，需开展结局试验以评估ASCVD获益在相关时间尺度上是否超过并发症风险。
