《Frontiers in Immunology》：Spatial multiomics identifies rheumatoid arthritis synovial niches and de-novo laminar histological patterns of fibroblasts subtypes
编辑推荐：
空间组学技术为组织内分子结构和空间细胞组织提供了深入见解。在类风湿性关节炎（RA）中，单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）和低分辨率空间转录组学已推进了对滑膜生物学的理解。然而，使用多种空间平台在单细胞
空间组学技术为组织内分子结构和空间细胞组织提供了深入见解。在类风湿性关节炎（RA）中，单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）和低分辨率空间转录组学已推进了对滑膜生物学的理解。然而，使用多种空间平台在单细胞空间分辨率下全面绘制RA滑膜中免疫细胞与基质细胞组织以及地形学细胞相互作用的研究仍然有限。方法：研究人员将单细胞和批量空间转录组学（分别为CosMx和Xenium，以及Visium）、空间液相色谱-质谱蛋白质组学（spatial LC/MS proteomics）和多重免疫组织化学蛋白panel整合到由6例RA、3例骨关节炎（osteoarthritis, OA）和3例健康（normal healthy, NH）关节镜滑膜活检组成的非临床队列的组织学评估中。组织病理学观察与基于Xenium的空间计算分析相结合，用于RA和NH滑膜，以确定RA与NH滑膜中成纤维细胞的组织和空间关系。结果：跨平台比较显示细胞组成和微解剖定位具有高度一致性，并强调了各技术的优势，其中单细胞空间分析提供了更高的细胞分辨率，但分子深度降低。单细胞空间转录组学与LC/MS蛋白质组学的比较也显示出一致性，但揭示了成纤维细胞相关基因和蛋白的区域特异性表达。研究人员在大活检组织中的空间定位识别出此前未被认识的层状组织，包含多达9种跨越RA滑膜衬里层（lining）和衬里下层（sublining）区域的成纤维细胞亚型，与NH明显不同。空间计算病理学分析表明，特定成纤维细胞亚型优先定位于淋巴（CD74+和CXCL12+）、血管（NOTCH3+和mural）和基质（POSTN+、DKK3+和CD34+）生态位中。通路富集分析进一步将特定生物学功能归因于与微环境相关的成纤维细胞亚型。结论：这项多模态空间分子病理学研究表明，在RA中成纤维细胞亚型扩展、发生空间重组，并建立可能促成疾病发病机制的特化组织生态位。这些发现提供了高分辨率空间框架，并支持未来针对未治疗（treatment na?ve）、治疗应答和治疗难治性RA患者开展空间多组学研究，以识别与治疗反应不足相关的组织水平空间特征。
类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种以关节滑膜炎症和新生血管化为特征的致残性自身免疫病，可导致严重疼痛并最终破坏关节软骨和骨。组织学上，健康滑膜由1–2层细胞厚的滑膜衬里层（synovial lining, SL）（含A型和B型纤维细胞）及包含纤维、疏松和/或脂肪组织的滑膜衬里下层（synovial sublining, SSL）组成。RA中滑膜衬里细胞层增厚、滑膜基质密度增加并出现炎症浸润，可通过Krenn滑膜炎评分和基于主要细胞类型的"病理型"（pathotype）进行分类。尽管单细胞RNA测序（scRNA-seq）和低分辨率空间转录组学已推进了对RA滑膜细胞组成和潜在驱动因素的理解，加速医学伙伴关系（AMP）联盟等报道了细胞类型丰度表型（CTAP），但使用多种空间平台在单细胞分辨率下全面绘制RA滑膜中免疫和基质细胞组织及其地形学相互作用的研究仍有限。为此，研究人员开展了一项多模态空间组学研究，将单细胞和批量空间转录组学、空间蛋白质组学与组织学相结合，以系统绘制健康与疾病状态下RA滑膜的空间细胞组织，重点解析成纤维细胞亚型的分布、生态位和功能。
研究人员使用了6例RA、3例骨关节炎（OA）和3例健康（NH）关节镜滑膜活检的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本（获自商业供应商，仅有年龄等人口统计学临床数据），在病理医生标注的6mm直径感兴趣区（ROI）内依次进行了三种空间转录组学检测——单细胞分辨率的CosMx（1K基因panel）和Xenium（MultiTissue-Custom 417基因panel及5K Pan Tissue panel），以及mini-bulk分辨率的Visium全转录组检测；同时在连续切片上开展了激光捕获显微切割联合液相色谱-质谱空间蛋白质组学（LCM-LC/MS proteomics）和多重免疫荧光（mIF-IHC）及显色免疫组化检测。计算分析流程包括：以AMP Phase 2 RA scRNA-seq数据集为参考，采用RCTD进行Visium spot去卷积、SingleR/Insitutype进行Xenium和CosMx细胞类型注释，并通过hoodscanR邻域分析、scimap空间相互作用评分、Local Moran's I空间自相关分析和ClusterProfiler基因本体论（GO）通路富集分析等手段进行数据整合与挖掘。
**3.1 多模态空间组学流程设计、质量控制、验证和基准测试**
**3.1.1 确保样本质量与病理特征明确**：所有RA样本经病理医生评估，除RA2为弥漫性髓系（diffuse-myeloid）病理型外，均为淋巴-髓系（lympho-myeloid）病理型。PPIB原位杂交评分均≥2，确认mRNA质量合格。
**3.1.2 各空间转录组学平台内部质量控制**：CosMx和Xenium的质控标准为每细胞中位≥15个转录本、≥70%基因高质量解码、错误解码率≤5%。RA5因组织脱片在CosMx中失败；RA1、RA2、NH1和NH2因Visium spot UMI数低于500被排除。
**3.1.3 跨平台细胞类型注释验证**：以Xenium为锚定平台，共注释了989,000个细胞为11个广谱细胞类型和42个扩展亚型，并通过病理医生视觉检查确认注释与mIF-IHC蛋白标记（CD248、CD68、CD3、CD8、CD20）高度吻合。RA滑膜中免疫细胞浸润约占全部细胞的54%，包括22%巨噬细胞、14%浆细胞、9%CD4 T细胞、6%B细胞和4%CD8 T细胞；与NH相比，RA中衬里和衬里下层成纤维细胞增加2倍，内皮细胞增加2.5倍，巨噬细胞增加11倍。
**3.1.4 不同空间转录组平台比较**：对CosMx、Xenium和Visium在连续切片上的细胞类型比例进行比较，结果高度一致，Pearson相关系数为0.89–0.92。差异基因表达分析显示，三种平台检测的成纤维细胞差异表达基因（如SPARC、COL1A1、PLIN2、CDH11、MMP3）在NH与RA间的表达趋势具有稳健相关性（r≥0.75）。
**3.1.5 Xenium空间转录组学与空间LCM LC/MS蛋白质组学整合**：对14个重叠成纤维细胞标记物的RNA和蛋白质配对比较显示，衬里与衬里下层比较时相关性最高（R=0.762，p=0.001），衬里与免疫SSL次之（R=0.603，p=0.02），免疫SSL与纤维SSL最低（R=0.526，p=0.05）。纤维SSL区域在mRNA和蛋白质水平均高表达COL1A1、COMP、MFAP5、PDGFRB、POSTN和THY1，而SL区域高表达FN1和PRG4。
**3.2 定义RA与健康滑膜组织中成纤维细胞亚型关联、组织学模式、空间生态位和功能**
**3.2.1 多个独立成纤维细胞亚型在滑膜中分层分布**：基于AMP2参考注释识别出9种成纤维细胞亚型（lining、mural、NOTCH3+、DKK3+、POSTN+、CD74+、CXCL12+、RSPO3+、CD34+）。CD74+成纤维细胞在RA中比例显著增加（NH 3.4% vs RA 22%），POSTN+亚型亦增加（NH 5.1% vs RA 18.5%），而CXCL12+（NH 22% vs RA 9.4%）和CD34+（NH 13.3% vs RA 3.4%）亚型减少并局限于特定区域。hoodscanR邻域分析显示RA中CD74+与RSPO3+、CD74+与CXCL12+、mural与NOTCH3+及POSTN+之间的邻域相关性显著增强。病理医生对coronin-1a免疫组化与Xenium数据的联合评估揭示了RA滑膜中"衬里下浅层（RSPO3+）→免疫富集中层（CD74+、mural、CXCL12+）→基质深层（POSTN+、DKK3+、CD34+）"的层状组织学新模式。
**3.2.2 成纤维细胞亚型定位于反映疾病组织功能和病理生理学的细胞生态位**：B细胞生态位分析显示，CD74+衬里下层成纤维细胞在距B细胞聚集体核心30μm内富集，峰值距离为15μm；mural成纤维细胞伴随微血管存在；衬里成纤维细胞在75μm处达到峰值。血管生态位分析显示，RA中mural细胞更严格限制于血管核心，NOTCH3+和POSTN+亚型与血管的关联增强，而NH中分布于血管远端的CXCL12+亚型在RA中减少或消失。
**3.2.3 疾病组织中成纤维细胞亚型空间组织程度增加**：Local Moran's I空间自相关分析显示，RA中所有成纤维细胞亚型的平均Moran's I值均显著高于NH，其中衬里（106.73 vs 22.06）、RSPO3+（64.12 vs 9.75）和CD74+（69.43 vs 14.74）亚型的差异最为显著，表明RA中成纤维细胞的空间聚集和有序化程度明显增加。
**3.2.4 疾病状态下成纤维细胞亚型的潜在功能作用**：GO-BP通路富集分析将9种成纤维细胞亚型归为4个功能类别：i) 促炎（lining、RSPO3+、CXCL12+）；ii) 细胞突起/迁移（POSTN+、CD74+、mural）；iii) 血管相关（NOTCH3+）；iv) 发育/分化（CD34+、DKK3+）。这些功能变化与亚型在RA滑膜中的空间定位紧密对应。
**讨论与结论**：讨论部分指出，该研究首次描述了RA滑膜中成纤维细胞亚型的层状地形学组织，确认了NOTCH3+成纤维细胞与血管的关联及POSTN+与NOTCH3+的相互作用，并发现CD74+成纤维细胞与B细胞聚集体紧密相关、可能支持免疫细胞聚集体的组织结构。研究建立的连续切片多空间组学工作流程和以组织学为基础的标准化方法，为在分子病理学实验室开展空间生物学研究提供了重要框架。结论部分可翻译为：总之，这项工作证实了先前报道并扩展了对RA与健康滑膜相比复杂细胞组织学组织的理解。通过组织学解析的空间多组学技术，研究人员揭示了病变滑膜中的成纤维细胞亚型存在于空间上不同的位置，并形成超越衬里层和衬里下层的多层组织和结构。当前的空间组学分析突出了如何在单细胞水平识别组织内的细胞定位、细胞间相互作用和潜在细胞功能。预计这种应用于临床相关样本的空间组学分辨率和深度的提高，将促进新治疗方法和生物标志物的开发，以帮助治疗决策。这项工作为未来更大规模的研究提供了基础，这些研究将提供与患者群体、治疗反应和治疗靶点相关的额外见解。
