肉瘤样分化透明细胞肾细胞癌中CDHR5和UPB1启动子甲基化与表达的关联研究

《Epigenetics Communications》：CDHR5 and UPB1 expression associated with promoter methylation in sarcomatoid differentiated clear cell renal cell carcinoma

摘要 背景：透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是最常见的肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）组织学亚型。肉瘤样（去）分化与转移播散及不良预后相关。DNA甲基化改变发生于ccRCC进展过程中，但其在肉瘤样分化出现中的具体作用仍不明确。本研究旨在发现可能识别ccRCC中肉瘤样特征的DNA甲基化生物标志物。 结果：研究人员利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）进行计算机模拟分析，评估肉瘤样ccRCC（sarcomatoid ccRCC，sccRCC）中差异甲基化基因，寻找与正常细胞功能、细胞干性和代谢相关的特定基因。随后，在一个组织队列（54例ccRCC和34例sccRCC）中对候选基因（启动子甲基化和表达）进行验证，采用Mann-Whitney U检验比较ccRCC与肉瘤样ccRCC组间的基因甲基化和转录水平，并通过绘制受试者工作特征曲线（Receiver Operator Characteristics，ROC）评估相应生物标志物的性能。sccRCC中CDHR5me和UPB1me水平显著升高，而转录水平在两个独立队列（TCGA和组织队列）中均显著降低。联合CDHR5me和UPB1me水平，区分sccRCC与ccRCC的特异性为78.7%，敏感性为63%。此外，sccRCC患者中CDHR5me水平升高与诊断时转移播散显著相关。 结论：CDHR5和UPB1通过启动子高甲基化发生的表观遗传改变与ccRCC中肉瘤样变化相关，可能作为识别这一变化的生物标志物。若能在液体活检中得到验证，该发现的临床实用性将进一步提升。

研究背景与科学问题

肾细胞癌（RCC）是一种高度异质性的肿瘤，其中透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是最常见的组织学亚型，约占所有RCC病例的70%-80%。ccRCC的发生发展与多种表观遗传调控酶的突变密切相关，包括Polybromo 1（PBRM1）、SET domain containing 2（SETD2）、组蛋白赖氨酸去甲基化酶（KDMs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）等。约4%-5%的RCC病例会出现肉瘤样（去）分化，且在ccRCC中较其他亚型更为常见。肉瘤样分化被认为是上皮-间充质转化（EMT）的显著激活表现，组织学上表现为从上皮形态向梭形细胞形态的急剧转变，伴随更高的多形性及经典特征的丧失，这使得诊断面临挑战，尤其是在穿刺活检中。肉瘤样RCC（sRCC）常被低估或误诊，与肿瘤体积大、坏死、转移、治疗反应有限及不良预后密切相关。

尽管已有研究揭示了ccRCC中基因组、表观基因组和代谢谱的部分特征，但sRCC仍然缺乏可靠的用于诊断、预后判断和治疗反应预测的生物标志物。特别是，关于肉瘤样ccRCC（sccRCC）中特异的表观基因组和代谢变化及其与常规ccRCC的差异，目前了解甚少。因此，研究人员旨在通过探索DNA甲基化模式的改变，寻找能够识别ccRCC中肉瘤样变化的分子标志物，以填补这一研究空白。

研究方法概述

研究人员首先利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库（来源于cBioPortal，筛选出33例sccRCC和50例ccRCC）进行计算机模拟分析，通过Shiny Methylation Analysis Resource Tool（SMART）App提取启动子区域CpG位点的甲基化数据，并结合RNA表达数据进行抗相关性分析。随后，在来自葡萄牙肿瘤研究所波尔图中心（IPO Porto）的独立组织队列（共88例福尔马林固定石蜡包埋标本，包括34例sccRCC和54例ccRCC）中进行验证。验证阶段采用了实时定量PCR（RT-qPCR）检测基因转录水平、多重定量甲基化特异性PCR（qMSP）检测启动子甲基化水平，以及免疫组织化学（IHC）检测蛋白表达水平。

研究结果

计算机模拟分析：基于文献筛选出的76个候选基因，在TCGA队列中发现64个基因在sccRCC中显著下调，12个基因显著上调。进一步筛选后，CDHR5和UPB1表现出启动子高甲基化与转录水平降低之间的显著负相关关系。sccRCC中CDHR5的三个CpG位点和UPB1的两个CpG位点甲基化水平显著高于ccRCC，同时两个基因的转录水平显著低于ccRCC。

独立队列验证：在IPO Porto队列中，RT-qPCR结果显示sccRCC样本中CDHR5和UPB1的转录水平显著低于ccRCC样本。IHC分析显示，UPB1蛋白（胞浆染色）在sccRCC中表达显著降低，与RNA表达数据一致；CDHR5蛋白（膜染色）也呈现相同趋势但未达到统计学显著性。qMSP分析证实，sccRCC样本中CDHR5_me和UPB1_me水平均显著高于ccRCC样本。

临床病理相关性：在sccRCC患者中，T2-T4期肿瘤的CDHR5和UPB1蛋白表达显著低于T1期肿瘤。CDHR5_me水平升高与诊断时存在转移（M1）及III/IV期疾病显著相关。

生物标志物性能：单独应用时，CDHR5_me区分sccRCC与ccRCC的敏感性为70.4%，UPB1_me的敏感性为74.1%，两者特异性相近。联合两个基因组成检测组合，区分sccRCC与ccRCC的特异性达78.7%，敏感性为63.0%。

讨论与结论

本研究首次报道了ccRCC中肉瘤样分化相关的表观遗传调控异常。研究发现CDHR5和UPB1在sccRCC中因启动子高甲基化导致表达下调，这两个基因可能作为识别肉瘤样分化的潜在生物标志物。CDHR5编码一种黏蛋白样蛋白，参与细胞黏附功能，其表达降低可能与肿瘤细胞解离、侵袭和迁移能力增强有关，从而促进转移扩散。UPB1参与嘧啶降解的最后一步，其在sccRCC中的低表达可能发挥抑癌作用。

该研究的临床意义在于：由于肉瘤样特征在穿刺活检中难以充分取材，通过检测这些甲基化标志物，可能在组织学表现为常规ccRCC的活检标本中实现肉瘤样分化的分子识别。若能在液体活检中得到验证，将为ccRCC患者的精准分层和治疗策略优化提供重要依据。

研究结论：CDHR5和UPB1通过启动子高甲基化发生的表观遗传改变可识别ccRCC中的肉瘤样变化，有望成为组织和/或液体活检中鉴定肉瘤样分化的生物标志物。如果在更大规模研究中得到验证，这些生物标志物的评估将对ccRCC患者的临床管理产生重要影响。