SALL1作为卒中脑scRNA-seq数据中区分小胶质细胞与血液来源髓系细胞的标记物

《Molecular Neurodegeneration》：SALL1 as a marker for distinguishing microglia from blood-derived myeloid cells in stroke brain scRNA-seq data

　　

在卒中相关的单细包RNA测序（scRNA-seq）数据中，由于小胶质细胞与浸润性髓系细胞共享髓系标记物，区分驻留小胶质细胞与浸润性髓系细胞仍然具有挑战性；SALL1相对于常用标记物（例如TMEM119、CX3CR1、P2RY12）对小胶质细胞具有更高特异性，并且将SALL1与这些常用标记物联合使用，可提升在卒中相关scRNA-seq数据集中区分小胶质细胞与浸润性髓系群体的能力。

《Molecular Neurodegeneration》刊发的该项研究围绕卒中后脑内驻留小胶质细胞与外周浸润性髓系细胞在单细包RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）中的鉴别难题展开。小胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system，CNS）内主要的驻留巨噬细胞，参与神经发育、突触重塑与神经炎症调控。卒中导致血脑屏障破坏后，单核细胞、巨噬细胞等外周髓系细胞大量进入脑实质，并与小胶质细胞共同塑造疾病进程与恢复过程。传统用于scRNA-seq小胶质细胞注释的规范标记物TMEM119、P2RY12和CX3CR1并不具备绝对特异性：TMEM119可在病理状态下下调，CX3CR1在单核细胞中高表达，P2RY12也可在血小板和T细胞中检出。生理状态下因外周髓系细胞极少进入CNS，这种非特异性影响有限；但在卒中条件下，驻留细胞与浸润细胞共享转录程序，常导致浸润性巨噬细胞被误注为小胶质细胞。因此，研究人员系统评估已发表卒中数据集中的小胶质细胞标记物，试图找到能准确区分驻留小胶质细胞与浸润性髓系细胞的基因。

为开展研究，研究人员使用了多队列数据：先是汇总19个卒中scRNA-seq与空间转录组数据集（来自17项研究）以统计常用小胶质细胞标记物；继而采用Garcia-Bonilla等发表的缺血卒中后2天和14天经FACS分选CD45^int与CD45^high免疫细胞的基准数据集；再以Shi等涵盖缺血与出血卒中亚型的scRNA-seq数据作为主要研究数据集；并补充独立卒中数据集以验证不同平台下SALL1表达特征。方法上主要包括标记物使用频率统计、外周免疫细胞表达谱比对、免疫组织化学与免疫荧光、流式细胞术分选与蛋白水平验证、Seurat标准流程与Harmony批次校正、聚类分辨率提升、混淆矩阵及经验累积分布函数（empirical cumulative distribution function，ECDF）等分析与再注释策略。

Fig. 1相关结果显示，研究人员统计19个卒中相关数据集中前10个小胶质细胞标记物使用频率，发现Tmem119、Cx3cr1、P2ry12最常用，且常采取Tmem119加P2ry12并补充Cx3cr1或Hexb的组合策略；HPA、Monaco、Schmiedel数据显示这四者在单核细胞、树突状细胞、粒细胞中均有表达，免疫组化也显示其在人外周免疫器官中可检出，HEXB在外周甚至比在小胶质细胞中更丰富，说明常用标记物特异性有限。SALL1方面，HPA、Monaco、Schmiedel数据均显示其主要在微胶质细胞表达，外周髓系谱系中极低；小鼠脑内SALL1呈核染色，骨髓无信号，免疫荧光中SALL1与IBA1在小胶质核内共定位。流式分析显示，假手术与卒中后24小时脑细胞中，CD11b⁺CD45^int小胶质细胞超90%为SALL1阳性，而CD11b⁺CD45^hi单核来源细胞（monocyte-derived cell，MdC）仅不到10%可检出SALL1蛋白。

在卒中情境验证中，研究人员利用Garcia-Bonilla等基准数据提取小胶质细胞、边界相关巨噬细胞（border-associated macrophage，BAM）与MdC进行分析。Tmem119、P2ry12、Cx3cr1、Hexb在MdC多个聚类中均有表达，而Sall1主要限于小胶质细胞聚类，并在时间进程中虽呈亚群波动但仍维持小胶质表达。ECDF分析表明Sall1在可检出细胞中于小胶质细胞内水平显著高于BAM与MdC；以固定检测阈值作二分类器时，Sall1特异性和精确性均大于97%，优于规范标记物；将Sall1与既有标记物整合可进一步提升注释表现。按Tmem119、P2ry12、Cx3cr1、Hexb均值计算基线分数后，小胶质、BAM、MdC聚类分数接近，但Sall1仅在小胶质中富集，非小胶质群体基本位于Sall1阴性区，证明Sall1是高于共享基线的增量签名。

主要研究数据集中，原“小胶质细胞/巨噬细胞”混合群体经提高分辨率后拆为15个亚聚类，仅6个亚聚类Sall1高表达并被稳健注为小胶质细胞；采用Sall1^high Tmem119⁺ P2ry12⁺组合可把混合髓系群体重新注释，UMAP上小胶质分布清晰一致。独立平台数据集也显示Sall1保持聚类特异性。研究人员指出，结论基于一个基准数据集与两个独立验证数据集，尚未充分评估动物造模方式、物种、人脑区差异、RNA降解、冻融 artifact、污染及更多测序技术的影响。

讨论部分强调，小胶质细胞与浸润髓系细胞因共同髓系起源而在scRNA-seq中难以分离，TMEM119、P2RY12、CX3CR1等规范标记物在卒中场景下不足以排除外周来源细胞。SALL1作为维持小胶质身份的转录因子，在mRNA与蛋白层面均表现出对驻留小胶质细胞的高选择性，将其纳入多标记注释可纠正混合聚类中的误注问题。研究意义在于为卒中脑scRNA-seq和空间转录组中的髓系细胞注释提供了更严谨的框架，减少把MdC或BAM误判为小胶质细胞的风险，从而让后续神经炎症、吞噬、突触修剪与修复相关结论更可靠。

研究结论可译为：在卒中相关scRNA-seq数据中，SALL1比TMEM119、CX3CR1、P2RY12等常用标记物更能特异标识驻留小胶质细胞；将SALL1^high与Tmem119⁺、P2ry12⁺结合，可提高小胶质细胞自外周血液来源髓系细胞中的辨识能力，改善卒中单细胞转录组里髓系亚群的注释准确性。