ProSAAS过表达阻止帕金森病大鼠α-突触核蛋白模型中运动缺陷的进展

《Translational Neurodegeneration》：ProSAAS overexpression arrests progression of motor deficits in a rat alpha-synuclein model of Parkinson’s disease

　　

专业摘要翻译
当前帕金森病（Parkinson’s disease, PD）的药物治疗仅缓解症状，并不能影响疾病进展。蛋白质分子伴侣（protein chaperone）为恢复PD及其他蛋白质病（proteinopathy）中的蛋白质稳态（proteostasis）提供了有前景的手段。ProSAAS是一种与路易小体（Lewy bodies）相关的神经内分泌肽前体蛋白，最近被鉴定为PD的潜在生物标志物。ProSAAS含有一段未加工的中央核心分子伴侣序列，可在体外阻止α-突触核蛋白（alpha-synuclein, α-Syn）纤维化；当ProSAAS过表达与α-Syn损伤同时启动时，可在体内防止α-Syn毒性的诱导。然而，在PD确诊时，多巴胺（dopamine, DA）末梢丢失已十分严重。因此，对具有治疗潜力的药物进行临床前评估时，必须证明其在显著病理发生之后启动治疗仍能发挥疗效。研究人员在此提供证据表明，在运动缺陷出现数周后启动黑质ProSAAS过表达，在动物模型中仍具有上述疗效。雄性大鼠接受表达人源α-Syn（human α-Syn, hα-Syn）的腺相关病毒（AAV）单侧注射至黑质（substantia nigra, SNc），4周或6周后，向同一区域注射表达ProSAAS或GFP的慢病毒。AAV-hα-Syn表达诱导了进行性的感觉运动（前肢支撑和放置测试）及自发运动（筒形测试）不对称。值得注意的是，在初始4周延迟实验中，lenti-proSAAS使自发运动不对称的进展被阻止，感觉运动不对称被完全逆转。对随机选择的部分动物进行死后分析表明，在AAV-hα-Syn损伤后8周，ProSAAS过表达减弱了纹状体TH末梢密度的不对称，并阻止了黑质TH+神经元数量相对于对侧结构的立体学评估减少。ProSAAS治疗动物在8周时TH+细胞的完全保护表明，在ProSAAS病毒递送时尚未发生显著DA细胞死亡；当时出现的运动不对称主要由TH下调和相关DA神经元功能障碍引起，而ProSAAS过表达阻止了其进展。为确定在病理进展更晚、损伤更广泛时启动ProSAAS过表达是否同样有效，后续实验采用6周延迟递送lenti-proSAAS。如预期，ProSAAS干预时不对称更为严重。然而，ProSAAS过表达再次阻止了自发运动不对称的进展，并在随后6周内同样阻止了感觉运动不对称的进一步进展。在该实验中，额外的对照组接受AAV-GFP并在6周后注射编码GFP的慢病毒。在12周时，hα-Syn+GFP治疗对照组相对于GFP+GFP对照出现显著纹状体TH末梢密度丢失，该丢失在proSAAS治疗动物中有所减轻，以前部纹状体最为有效。hα-Syn+GFP动物黑质中TH+细胞数量显著减少；该减少在proSAAS治疗大鼠中虽仍显著，但被明显减弱。研究人员接着寻求证据支持所观察到的proSAAS保护作用与其先前报道的抗α-Syn纤维化特性相关。α-Syn在丝氨酸129位点的磷酸化（p129-α-Syn）是与该蛋白聚集形式相关的关键翻译后修饰。在4周延迟实验中，hα-Syn+GFP治疗对照组注射侧黑质可见大量p129-α-Syn标记细胞。注射lenti-proSAAS的大鼠尽管TH+神经元明显更多，但p129-α-Syn标记细胞显著更少。值得注意的是，在6周延迟实验中，12周时两组中表现p129-α-Syn染色的细胞数量相似，但proSAAS治疗动物中存留的TH阳性神经元约为3倍更多，表明在这些治疗动物中，较低比例的存活多巴胺神经元表现出病理性α-Syn。虽然并非定论，这些数据支持proSAAS通过α-Syn蛋白质稳态机制发挥作用。4周时启动proSAAS过表达使感觉运动功能障碍被逆转而非仅仅阻止其进展，提示proSAAS不仅可能限制了病理性α-Syn的细胞间传播，还可能对受影响细胞施加了修复功能。为研究这种蛋白质稳态是否包括促进已形成聚集物的清除，研究人员进行了后续实验：单独注射AAV-hα-Syn并在2–8周后处死动物，以确定proSAAS干预时p129-α-Syn标记的程度。数据显示p129-α-Syn标记早在2周即出现，与黑质TH+细胞计数和纹状体TH末梢密度的不对称同时发生。尽管该实验中4周时p129-α-Syn免疫反应细胞数量高于4周延迟实验中proSAAS治疗动物8周时观察到的数量，但在此处无proSAAS治疗的情况下，4至8周之间也出现类似下降。因此无法得出结论认为proSAAS清除了已形成的聚集物。事实上，研究人员既往体外数据表明，proSAAS可以阻止α-Syn纤维化，但不能解聚已聚集的蛋白。鉴于越来越多的共识认为路易小体并非PD中的毒性实体，而是神经元试图缓解蛋白质稳态失调的表现，可溶性寡聚体才是关注的毒性物种，这一点在基于该方法的潜在治疗开发中可能并不重要。值得注意的是，该后续研究中8周时p129-α-Syn标记细胞数量远低于4周延迟实验中hα-Syn+GFP组8周时的计数，而TH+细胞计数则相反，在后续实验该时间点略高。这表明lenti-GFP注射的“第二次打击”可能影响了细胞处理病理性α-Syn的能力。AAV和慢病毒注射具有促炎作用，且大量文献支持炎症过程在PD中的作用。为初步研究炎症是否是该双病毒模型的重要组成，研究人员使用小胶质细胞标志物Iba-1对黑质进行了半定量免疫细胞化学分析，比较AAV-hα-Syn单独组6–8周与4周延迟实验中注射AAV-hα-Syn加lenti-GFP动物8周时的染色。虽然两组均存在对注射的炎症反应证据，但组间无差异，提示慢病毒本身或GFP并未增加AAV-hα-Syn注射的炎症损伤。研究人员还研究了小胶质细胞吞噬细胞外α-Syn是否解释了lenti-GFP注射动物中p129-α-Syn阳性细胞升高，但两种标志物几乎无共定位。另一种解释是，GFP表达带来的额外蛋白质稳态负荷加重了α-Syn损伤的负荷，导致病理性α-Syn累积增多。最后，lenti-proSAAS治疗动物的炎症反应呈降低趋势。为进一步研究这是否反映了proSAAS针对AAV载体本身或hα-Syn产物的促炎作用具有活性，研究人员对6周延迟实验的组织进行了类似分析，该实验包含AAV-GFP+lenti-GFP对照组。在该情况下，初始AAV-hα-Syn损伤后12周，AAV-hα-Syn/lenti-proSAAS组的炎症显著低于AAV-hα-Syn/lenti-GFP组。然而，AAV-GFP/lenti-GFP注射动物也表现出不同程度的炎症反应。因此，proSAAS的抗炎作用可能并非特异性针对hα-Syn过表达诱导的炎症，但可能通过减少对病毒注射的炎症反应而对其在该模型中的治疗效果有所贡献。有趣的是，ProSAAS除较大的未加工中央核心伴侣序列LARALL外，还被终末加工为若干小生物活性肽。这些肽包括BigLEN，即G蛋白偶联受体GPR171的配体，激活该受体可抑制免疫细胞功能。虽然目前纯属推测，但proSAAS过表达后此类肽的可用性增加，可能减弱免疫激活在该模型中的任何贡献，值得进一步研究。研究人员认识到本研究存在若干局限性。首先，虽然所用样本量是此类初步临床前研究的常规水平，但将研究扩展到更大数量的动物（包括雌性）以及其他PD模型（如α-Syn预形成原纤维模型）将非常重要。此外，需要采用寡聚体/原纤维负荷的生化测量和/或证明p129-α-Syn免疫反应性的蛋白酶K抗性，以辨别proSAAS是否影响可溶性蛋白与聚集形式。最后，需要对proSAAS过表达的抗炎效应及其对该模型治疗结局的潜在贡献进行更深入、多标志物的分析，以验证这些初步发现。总之，本研究证明，在临床相关的延迟干预PD动物模型中，proSAAS过表达可以阻止运动功能障碍的进展。结合研究人员既往数据（proSAAS在PD、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化的细胞和动物模型中具有抗纤维化特性），该研究为基于proSAAS的多种神经退行性蛋白质病潜在疗法的进一步研究提供了有力依据。

论文解读文章

帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是全球第二大神经退行性疾病，其主要病理特征是中脑黑质（substantia nigra, SNc）多巴胺能神经元进行性丢失以及残存神经元内α-突触核蛋白（alpha-synuclein, α-Syn）聚集形成路易小体（Lewy bodies）。目前临床上的药物治疗（如左旋多巴）仅能缓解运动症状，无法阻止或逆转疾病进展。由于PD患者在确诊时往往已经出现显著的多巴胺（dopamine, DA）末梢丢失，因此任何具有治疗潜力的候选药物必须在病理已启动之后给予干预仍能显示疗效，才具有临床转化价值。蛋白质分子伴侣（protein chaperone）被认为是恢复蛋白质稳态（proteostasis）的潜在策略。ProSAAS是一种神经内分泌肽前体蛋白，与路易小体相关，并已被鉴定为PD的潜在生物标志物。ProSAAS含有一段未加工的中央核心伴侣序列，在体外可阻止α-Syn纤维化；既往研究表明，当ProSAAS过表达与α-Syn损伤同时启动时，可在体内防止α-Syn毒性。然而，尚不清楚在运动缺陷已出现数周后启动ProSAAS过表达是否仍能阻止疾病进展。该研究正是在这一临床相关背景下，探索延迟递送ProSAAS基因对PD模型大鼠的治疗效果。研究发表于《Translational Neurodegeneration》。

研究人员采用黑质内单侧注射表达人源α-Syn（human α-Syn, hα-Syn）的腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）建立大鼠PD模型，分别在注射后4周或6周向同一区域注射表达ProSAAS或绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的慢病毒，以模拟疾病发病后的延迟干预。研究通过行为学测试（前肢支撑、放置测试、筒形测试）评估运动不对称的进展，并通过免疫组织化学、立体学计数和半定量免疫细胞化学分析评估酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）阳性多巴胺能神经元及末梢密度、p129-α-Syn免疫反应细胞数量及小胶质细胞标志物Iba-1的炎症反应。研究还设置了AAV-hα-Syn单独注射的随访实验以及AAV-GFP加lenti-GFP的对照。样本均来自雄性大鼠，各组动物数量为每组6–10只不等。

研究结果分为几个部分。第一，4周延迟实验中，ProSAAS过表达阻断了自发运动不对称的进展，并完全逆转了感觉运动不对称；在6周延迟实验中，尽管干预时运动缺陷更为严重，ProSAAS过表达仍阻止了自发运动和感觉运动不对称的进一步进展。第二，死后分析显示，在AAV-hα-Syn损伤后8周，4周延迟实验中ProSAAS治疗显著减弱了纹状体TH末梢密度的不对称，并完全阻止了黑质TH+神经元数量的减少。第三，在6周延迟实验中，hα-Syn+GFP对照组出现显著TH末梢密度丢失和TH+神经元数减少，而ProSAAS治疗显著减轻了这些改变，其中纹状体前部保护效果最明显。第四，关于p129-α-Syn，4周延迟实验中ProSAAS治疗组尽管TH+神经元数量更多，但p129-α-Syn标记细胞显著减少；在6周延迟实验中两组p129-α-Syn标记细胞数量相似，但ProSAAS组存活的TH阳性神经元约为对照组3倍，提示治疗组中存活多巴胺神经元内病理性α-Syn的比例更低。第五，随访实验表明p129-α-Syn标记早在AAV-hα-Syn注射后2周即出现，且在无ProSAAS治疗情况下4至8周之间也存在自然下降，因此无法确定ProSAAS能够清除已形成的聚集体。第六，炎症分析显示，在6周延迟实验中，AAV-hα-Syn/lenti-proSAAS组的炎症反应显著低于AAV-hα-Syn/lenti-GFP组，但AAV-GFP/lenti-GFP对照组也表现出炎症，提示ProSAAS的抗炎作用可能并非特异性针对hα-Syn诱导的炎症，但可能通过降低对病毒注射的炎症反应而参与其治疗效果。此外，研究未发现小胶质细胞对细胞外α-Syn的吞噬是p129-α-Syn阳性细胞增多的主要原因；GFP表达本身可能增加了蛋白质稳态负荷，导致病理性α-Syn累积增多。

讨论部分指出，ProSAAS在4周延迟时不仅能阻止运动功能障碍进展，还能逆转已出现的感觉运动不对称，提示其可能不仅限制了病理性α-Syn的细胞间传播，还影响了受影响细胞内的蛋白质稳态，可能通过分泌和内涵体再摄取后促进α-Syn的正确折叠、靶向和降解。然而，结合既往体外数据，ProSAAS只能阻止α-Syn纤维化，不能解聚已形成的聚集体。由于目前普遍认为路易小体并非PD中的主要毒性实体，而可溶性寡聚体才是关键毒性物种，因此这一局限可能不影响基于ProSAAS的治疗策略的开发。研究还讨论了双病毒模型中炎症的可能影响以及ProSAAS衍生肽（如BigLEN及GPR171受体）在免疫调节方面的潜在作用，但认为尚需进一步研究。

研究结论指出，本研究表明在临床相关的延迟干预动物模型中，ProSAAS过表达可以阻止运动功能障碍的进展。结合既往研究证明ProSAAS在PD、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化模型中具有抗α-Syn纤维化特性，该研究支持进一步开发基于ProSAAS的、针对多种神经退行性蛋白质病的治疗策略。该研究的主要意义在于首次证明了ProSAAS基因递送在疾病症状出现后启动仍具有治疗潜力，为PD的疾病修饰治疗提供了新的方向。