CRISPR/Cas9介导斑马鱼酪氨酸酶与OCA2基因敲除及表型分析

《BMC Biotechnology》：CRISPR/Cas9 induced disruption of oca2 and tyr genes associated with pigmentation in Danio rerio

摘要

靶导向基因破坏已在若干模型鱼和非模型鱼种中成功实施。在观赏鱼产业中，斑马鱼（Danio rerio，D. rerio）是最重要的鱼种之一，且具有多种颜色品种。近年来，CRISPR/Cas9已被用于破坏多种鱼（包括D. rerio）的色素基因。然而，迄今为止，关于利用CRISPR/Cas9破坏D. rerio中酪氨酸酶（tyr）和眼皮肤白化症II（oca2）等色素基因的报道仍较少。本研究针对tyr（T1）和oca2（T2）基因设计并合成了特异性向导RNA（gRNA）构建体，同时通过体外转录合成了Cas9 mRNA。随后，利用凝胶电泳和测序对Cas9 mRNA和gRNA构建体进行了验证。验证后的Cas9 mRNA与gRNA混合物随后共显微注射入通过自然产卵获得并在受控条件下饲养的D. rerio 1–2细胞期胚胎。凝胶电泳和测序结果证实了针对T1和T2的Cas9 mRNA及gRNA构建体的成功合成与验证。根据Fo和F1突变体的表型研究，当T1和T2基因被破坏时，黑色素细胞减少，导致可见的色素变化。此外，本研究开发的经验证的基因编辑构建体可作为其他观赏鱼种进行定向色素修饰的有用工具，从而支持高价值观赏品系的培育，并推动水产养殖中的遗传改良计划。然而，仍需在分子水平上进行进一步研究，通过基因分型确认突变。