基于基因组规模模型与氧化还原工程优化 K. phaffii 重组蛋白产量研究

《Microbial Cell Factories》：Metabolic impact of redox perturbations on recombinant protein production in Komagataella phaffii under methanolic growth conditions

　　

摘要

背景

重组蛋白的体外生产在能量消耗和氧化还原辅因子再生方面要求很高。诸如Komagataella phaffii（又称Pichia pastoris）这样的酵母似乎通过增加ATP、NADH或NADPH的再生能力来适应这一高耗费过程的代谢负担。早期研究表明，当以葡萄糖作为唯一的碳源时，提高NADPH的再生能力对重组蛋白的生产有积极影响，而同时对抗NADH/NAD⁺比例的增加也被证明是有益的。

结果

为了评估通过引入细胞质NADH激酶和替代NADH氧化酶所导致的NADPH和/或NAD⁺再生增加的代谢影响，我们首先基于基因组规模模型进行了计算机模拟。接下来，我们在生产Rhizopus oryzae脂肪酶（Rol）的K. phaffii菌株中，研究了过表达S. cerevisiae的POS5 NADH激酶编码基因（靶向细胞质）和替代氧化酶(AtOX)的效果，该菌株在酒精氧化酶1(AOX1)启动子(P_{AOX1)的控制下进行生产。通过这些方法，我们评估了这些工程策略在甲醇生长条件下对重组蛋白生产和细胞性能的影响。小规模培养实验表明，这种基因改造显著提高了甲醇生长条件下的蛋白产量。进一步地，我们在使用葡萄糖/甲醇混合物（60/40%，w/w）作为碳源的生物反应器恒化培养中表征了这些经过氧化还原工程改造的菌株，证实了其性能。结果表明，过表达两个拷贝的POS5可使Rol的特异性产量提高36%，而AtOX的过表达并未改善产量。值得注意的是，同时过表达两个拷贝的POS5和AtOX可使脂肪酶产量比参考菌株提高53%，这表明NADH/NAD⁺比例的扰动会导致广泛的代谢变化，最终影响细胞生长和产物形成，从而产生观察到的叠加效应。利用基因组规模代谢模型对恒化培养的生理数据进行计算机模拟解析，使我们能够进一步了解这些改造的代谢影响。}

结论

我们的研究提供了一种DBTL工作流程，为定量理解细胞对基于氧化还原的扰动的响应以及随后在K. phaffii中测试代谢工程应用提供了宝贵的见解。