杠柳毒苷通过下调4EBP1激活eIF4E诱导骨肉瘤细胞坏死性凋亡和焦亡

《Biology Direct》：Periplocin suppresses osteosarcoma progression by triggering necroptosis and pyroptosis through the “4EBP1-eIF4E” pathway

摘要

背景

骨肉瘤（OS）是一种侵袭性骨肿瘤，预后较差，亟需新的治疗策略。杠柳毒苷（Periplocin）是一种源自中药的心强苷，已在多种癌症中显示出抗肿瘤效果。然而，其在骨肉瘤中的作用尚不明确。本研究旨在探讨杠柳毒苷是否通过诱导骨肉瘤细胞的坏死性凋亡和焦亡发挥抗癌作用，并探究其潜在的调控机制。

方法

使用杠柳毒苷处理人骨肉瘤和U2 OS细胞系，通过细胞计数试剂盒-8、Transwell、划痕愈合、集落形成和流式细胞术检测评估细胞活力、迁移、增殖和细胞死亡。利用特异性抑制剂（坏死性凋亡抑制剂-1 [Nec-1] 和二乙基二硫代氨基甲酸酯 [DSF]）以及关键标志物（磷酸化受体互作蛋白激酶3 [p-RIP3]、磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白 [p-MLKL]、含Caspase募集域的凋亡相关点状蛋白 [ASC]、Caspase-1、Gasdermin D [GSDMD]、白细胞介素-1 [IL-1] 和NOD样受体家族富含Pyrin结构域蛋白3 [NLRP3]）的Western blot分析评估坏死性凋亡和焦亡的参与。通过eIF4E siRNA敲低、药物抑制（4EGI-1）、磷酸模拟突变体eIF4E过表达和4EBP1过表达检验4EBP1-eIF4E通路的作用。利用免疫共沉淀（Co-IP）验证杠柳毒苷诱导的抗骨肉瘤作用过程中4EBP1与eIF4E相互作用的变化。使用异种移植小鼠模型验证体内抗肿瘤效果。

结果

杠柳毒苷以剂量和时间依赖的方式显著抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和集落形成。此外，杠柳毒苷诱导了坏死性凋亡和焦亡，表现为p-RIP3、p-MLKL、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1和NLRP3表达升高以及骨肉瘤细胞死亡增加。使用Nec-1或DSF处理后，这些效应减弱。此外，eIF4E敲低和抑制以及4EBP1过表达减少了杠柳毒苷诱导的骨肉瘤细胞死亡，并促进了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和集落形成。磷酸模拟突变体eIF4E过表达部分逆转了eIF4E敲低的促瘤作用。免疫共沉淀结果显示，杠柳毒苷处理后eIF4E-4EBP1相互作用显著降低。在体内，杠柳毒苷抑制了肿瘤生长并增强了肿瘤组织中的坏死性凋亡和焦亡标志物；eIF4E抑制部分消除了这些抗肿瘤效果。

结论

本研究揭示了一种新的机制：杠柳毒苷通过下调4EBP1导致eIF4E激活，进而诱导坏死性凋亡和焦亡，从而抑制骨肉瘤进展。这些发现凸显了杠柳毒苷和4EBP1-eIF4E通路作为骨肉瘤治疗潜在靶点的 therapeutic 潜力。