植物生长调节剂CCC与PBZ对腹足类脑神经节P物质免疫反应性的影响——基于Semperula maculata与Bellamya bengalensis的免疫组织化学研究

《The Journal of Basic and Applied Zoology》：Immunohistochemical analysis of substance P from cerebral ganglion of S. maculata and B. bengalensis

　　

背景：农业生产中常施用各类化学物质和肥料以促进植物生长，然而其过度使用会造成环境污染，并对无脊椎动物和脊椎动物均产生不利影响。本研究旨在探究植物生长调节剂矮壮素（Chlormequat chloride, CCC）和多效唑（Paclobutrazol, PBZ）暴露96小时后，对Semperula maculata和Bellamya bengalensis脑神经节神经元细胞中P物质（Substance P, SP）免疫反应性的影响。研究人员将SP免疫反应性定量为免疫染色面积百分比，以评估这两种植物生长调节剂诱导的神经化学改变。

结果：与对照组相比，CCC和PBZ暴露后，两种腹足类动物的SP免疫反应性均显著升高。在两种植物生长调节剂中，PBZ诱导的SP免疫反应性增幅大于CCC。在Semperula maculata中，CCC暴露后免疫反应性升高14.35%，PBZ暴露后升高16.77%；类似地，在Bellamya bengalensis中，CCC和PBZ暴露后免疫反应性分别升高10.71%和12.31%。

结论：比较分析显示，Semperula maculata的SP免疫反应性相对增幅较大，而Bellamya bengalensis在所有实验条件下均表现出更高的总体SP免疫反应性。这些发现表明，CCC和PBZ可诱导腹足类动物发生显著的神经化学改变，提示其对非靶标无脊椎动物具有潜在神经毒性效应。该研究强调，有必要在陆生和水生生态系统中监测这些植物生长调节剂的环境影响。

论文解读：植物生长调节剂CCC与PBZ对腹足类脑神经节P物质免疫反应性的影响

一、研究背景与目的

现代农业依赖各类农用化学品来提高作物产量，其中植物生长调节剂（plant growth regulators, PGRs）因其用量小、见效快而被广泛使用。然而，过量施用或不当管理会导致PGRs通过农业径流、淋溶等途径进入陆生和水生生态系统，进而在植物和动物体内蓄积，并沿食物链传递，最终可能危及人类健康。已有研究表明，PGRs对非靶标生物（尤其是无脊椎动物）的神经系统可能产生不良影响，但相关神经毒性证据仍然有限。正是基于这一环境安全关切，研究人员选取了分别栖息于陆生与淡水环境的两种腹足类动物——陆生蛞蝓Semperula maculata和水生螺类Bellamya bengalensis，以P物质（Substance P, SP）为神经化学标志物，探究典型PGRs矮壮素（CCC）和多效唑（PBZ）暴露96小时后，其脑神经节中SP免疫反应性的变化，以期评估这两类环境污染物对非靶标无脊椎动物的潜在神经毒性。

二、研究方法概述

研究人员共使用两种腹足类动物，每组设5个生物重复（n=5），每只动物取一个脑神经节切片，使用ImageJ软件进行免疫反应性定量分析，并重复三次。暴露浓度采用前期急性毒性试验确定的96小时半数致死浓度（LC??）：S. maculata的CCC为5888.06 ppm、PBZ为4243.20 ppm；B. bengalensis的CCC为175.53 ppm、PBZ为46.163 ppm（Tendulkar和Kamble, 2023, 2024）。免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）染色流程包括：石蜡切片（5–7 μm）、脱蜡复水、EDTA（pH 9）抗原修复、3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶、小鼠抗SP IgG1一抗（1:50）孵育、Dako EnVision聚合物系统二抗结合、DAB显色及苏木精复染。通过ImageJ量化DAB阳性染色面积百分比，反映SP免疫反应性强度。该研究未设置阴性对照（如一抗缺失对照）、同型对照及阳性组织对照。

三、研究结果

（一）S. maculata脑神经节形态与SP免疫反应性

S. maculata为神经节型神经系统，共有11个神经节，包括一对颊神经节、一对脑神经节、一对侧神经节、一对足神经节、一对壁神经节和一个内脏神经节。脑神经节呈蝴蝶形，内含巨大、大型、中型和小型神经元细胞，细胞分布于神经节外周。免疫组织化学分析显示，对照组S. maculata脑神经节中SP免疫反应性面积百分比为8.05%；经96小时CCC暴露后，该值显著升至22.40%；而PBZ暴露后进一步升至24.82%。与对照组相比，CCC暴露使SP免疫反应性升高14.35个百分点，PBZ暴露则升高16.77个百分点。

（二）B. bengalensis脑神经节形态与SP免疫反应性

B. bengalensis的神经系统规模较小，同样含一对颊神经节、一对脑神经节、一对侧神经节、一对足神经节和一个内脏神经节。脑神经节呈哑铃形，位于背侧、口腔球上方，主要调控触角和眼等感觉器官。免疫组化结果显示，对照组B. bengalensis脑神经节SP免疫反应性面积百分比为14.33%；经CCC暴露96小时后增至25.04%；PBZ暴露后进一步增至26.64%。与对照组相比，CCC暴露使SP免疫反应性升高10.71个百分点，PBZ暴露升高12.31个百分点。

（三）两种腹足类SP免疫反应性的比较评估

综合分析显示，两种腹足类动物在对照组和实验组中均表现出种间差异：B. bengalensis在所有条件下SP免疫反应性总体水平均高于S. maculata，提示该物种在静息状态下具有更高的SP基础表达；然而，从相对增幅来看，S. maculata在CCC和PBZ暴露后的升高幅度（14.35%和16.77%）大于B. bengalensis（10.71%和12.31%），表明陆生蛞蝓对PGRs的神经化学响应更为敏感。

四、讨论与结论

讨论部分指出，软体动物尽管神经元数量较少，但其神经系统中存在高水平的神经肽，这些神经肽作为神经递质、神经调质或神经激素，在调节生长、代谢、繁殖等生理过程中发挥关键作用。速激肽（tachykinins, TKs）家族成员SP在哺乳动物及多种无脊椎动物中广泛分布，参与痛觉传导、神经源性炎症及应激反应。已有研究发现，SP样免疫反应性存在于蚯蚓（Lumbricus terrestris）的体神经节和消化管壁、贻贝（Mytilus galloprovincialis）足神经节单极神经元中，以及甲壳类动物（Cancer borealis、Homarus americanus、Panulirus interruptus）的神经网中。本研究在两种腹足动物脑神经节中观察到SP免疫反应性，与上述文献报道一致。此外，SP在鱼类（如尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus）中可调节炎症并提高细菌感染存活率，在大鼠肠道中有约50%的黏膜下神经元和三分之一肌间神经元呈SP阳性。这些证据共同支持SP作为应激相关神经肽的保守性功能。本研究结果显示，CCC和PBZ均能显著上调两种腹足动物脑神经节中SP的表达，且PBZ的效应强于CCC，提示这两种PGRs可能通过激活SP相关神经通路引起应激性神经化学改变。

研究结论：暴露于植物生长调节剂矮壮素（CCC）和多效唑（PBZ）96小时后，两种软体动物S. maculata和B. bengalensis脑神经节神经元细胞中的P物质免疫反应性均显著升高。PBZ暴露组较CCC暴露组升高更为明显，表明PBZ具有更强的神经毒性效应。SP免疫反应性的升高提示与神经元应激和细胞损伤相关的神经化学活动增强。这些发现证明，这两种植物生长调节剂可对非靶标软体动物的神经系统产生不利影响，其中PBZ的潜在神经毒性更强。该研究未设置阴性对照（一抗缺失对照）、同型对照及阳性对照组织，结果解释需谨慎。本研究强调了在陆生和水生生态系统中监测这些植物生长调节剂环境影响的必要性。