《Apoptosis》：GNMT alleviates heart failure-induced skeletal muscle atrophy by regulating ATP5J2-mediated mitochondrial metabolic reprogramming through succinylation
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心力衰竭（Heart failure，HF）是一种以心脏结构或功能异常为特征、导致心脏无法及时向组织输送氧气、并可能进展为骨骼肌萎缩等症状的疾病。本研究主要聚焦于甘氨酸N-甲基转移酶（Glycine N-methyltransferase，GNMT），一种利用
心力衰竭（Heart failure，HF）是一种以心脏结构或功能异常为特征、导致心脏无法及时向组织输送氧气、并可能进展为骨骼肌萎缩等症状的疾病。本研究主要聚焦于甘氨酸N-甲基转移酶（Glycine N-methyltransferase，GNMT），一种利用S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）催化甘氨酸的酶，以探索其在HF诱导的骨骼肌萎缩中的具体作用。研究中建立了由腹主动脉缩窄（abdominal aortic constriction，AAC）诱导的HF大鼠模型以及由血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）诱导的C2C12肌肉萎缩细胞模型。采用超声心动图、酶联免疫吸附测定（ELISA）和HE染色评估心肌及腓肠肌组织的损伤情况；采用免疫荧光染色评估骨骼肌萎缩程度；采用Western blot、免疫沉淀（IP）和免疫共沉淀（Co-IP）确定分子机制。在HF大鼠中，GNMT和线粒体Fo复合物亚基F2（ATP5J2）的表达显著降低。GNMT/ATP5J2的过表达有助于缓解HF诱导的骨骼肌萎缩。GNMT通过消耗甘氨酸，提高了ATP5J2在赖氨酸22（K22）位点的琥珀酰化水平及蛋白稳定性，同时降低了其泛素化水平。琥珀酰化的ATP5J2改善了线粒体稳态，从而减轻了HF诱导的骨骼肌萎缩。本研究阐明了GNMT-ATP5J2轴在HF诱导的骨骼肌萎缩中的功能，并明确了其潜在的分子机制，为HF诱导的骨骼肌萎缩的治疗提供了新的理论基础。
论文解读
一、研究背景与科学问题
心力衰竭（Heart failure，HF）是多种心血管疾病进展的终末阶段，患者常因心脏泵血功能受损而出现疲劳、嗜睡和运动耐量下降等症状。近年来，HF诱导的骨骼肌萎缩受到广泛关注。据统计，超过68%的HF患者存在不同程度的骨骼肌功能障碍，约31%表现出明显的骨骼肌萎缩。骨骼肌萎缩不仅严重影响HF患者参与心脏康复训练的能力，还显著增加跌倒、残疾和死亡的风险，已成为HF患者预后的独立危险因素。
HF诱导骨骼肌萎缩的病理生理机制极为复杂，其中线粒体代谢异常被认为是触发骨骼肌萎缩的最早指标之一。研究表明，在HF背景下，骨骼肌细胞线粒体内三羧酸循环（TCA cycle）关键酶——柠檬酸合酶和琥珀酸脱氢酶的活性显著降低，氧化磷酸化（OXPHOS）功能受损。线粒体代谢异常不仅损害骨骼肌细胞的摄氧能力，还导致钙稳态失衡、活性氧过载以及氧化与合成代谢平衡紊乱，最终加速骨骼肌萎缩的进展。然而，目前HF诱导骨骼肌萎缩中线粒体代谢异常的关键调控机制尚未完全阐明。
甘氨酸N-甲基转移酶（GNMT）是调控S-腺苷甲硫氨酸（SAM）代谢的关键酶，主要催化SAM的甲基转移至甘氨酸，生成S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）和肌氨酸。既往研究发现GNMT可通过调控电子传递链复合物Ⅱ活性增强线粒体功能，且GNMT缺乏可通过SAM依赖和非依赖途径损害线粒体氧化代谢。值得注意的是，甘氨酸代谢与琥珀酰辅酶A（succinyl-CoA）水平密切相关——甘氨酸可降低琥珀酰-CoA水平。然而，GNMT是否通过催化甘氨酸调控线粒体稳态进而影响HF诱导的骨骼肌萎缩，此前尚不清楚。
琥珀酰-CoA不仅是TCA循环的重要代谢中间体，也是蛋白质赖氨酸琥珀酰化（Ksucc）的主要供体。与传统的乙酰化和甲基化修饰不同，琥珀酰化可将赖氨酸残基的电荷从+1改变为?1，从而对蛋白质结构和功能产生更显著的影响。越来越多的研究表明，线粒体功能稳态受到蛋白质琥珀酰化的精确调控，涵盖TCA循环、脂肪酸代谢和OXPHOS等核心生物学过程。然而，琥珀酰化修饰在HF诱导的骨骼肌萎缩中的作用仍知之甚少。
线粒体Fo复合物亚基F2（ATP5J2）是线粒体ATP合酶（复合物Ⅴ）的重要组分，定位于线粒体嵴边缘，在OXPHOS中发挥关键作用。既往研究表明，ATP5J2在三阴性乳腺癌中表达下调，导致细胞能量缺乏并损害线粒体膜电位和结构；敲低ATP5J2会加剧线粒体膜损伤，破坏线粒体稳态。这些发现提示ATP5J2的表达对维持线粒体功能至关重要，并可能在骨骼肌萎缩过程中发挥重要作用。
基于上述背景，本研究旨在通过体内外实验阐明GNMT-ATP5J2轴在HF诱导骨骼肌萎缩中的调控机制。
二、研究概述与主要结论
研究人员建立了AAC诱导的HF大鼠模型和Ang Ⅱ诱导的C2C12骨骼肌萎缩细胞模型，通过过表达GNMT或ATP5J2、敲低ATP5J2以及运动干预等手段，系统探究了GNMT-ATP5J2轴在HF诱导骨骼肌萎缩中的作用机制。研究发现，HF大鼠腓肠肌组织中GNMT和ATP5J2的表达均显著降低；过表达GNMT或ATP5J2均可有效缓解HF诱导的骨骼肌萎缩。机制上，GNMT通过其催化甘氨酸的活性恢复体内琥珀酰-CoA水平，进而促进ATP5J2在K22位点的琥珀酰化修饰（由CPT1A介导），抑制其泛素化降解，增强蛋白稳定性，改善线粒体稳态，最终抑制骨骼肌萎缩。此外，对GNMT过表达的HF大鼠实施适度运动干预，可促进肌肉释放琥珀酸，进一步增强ATP5J2的琥珀酰化水平，协同缓解骨骼肌萎缩。该研究阐明了GNMT-ATP5J2轴在HF诱导骨骼肌萎缩中的功能及分子机制，为临床治疗提供了新的潜在靶点和策略。
三、主要关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：①动物模型构建：通过腹主动脉缩窄（AAC）手术建立HF大鼠模型，并通过尾静脉注射AAV9-GNMT、AAV9-ATP5J2及AAV9-shATP5J2载体实现基因过表达和敲低；②细胞模型构建：使用Ang Ⅱ处理C2C12小鼠成肌细胞建立骨骼肌萎缩细胞模型；③心脏功能评估：采用超声心动图检测左心室内径、射血分数（EF）和短轴缩短率（FS），ELISA检测血清NT-proBNP水平；④骨骼肌萎缩评估：采用HE染色观察肌纤维形态、抓力测试和跑台力竭实验评估肌力与运动能力、免疫荧光染色检测MYH1和MYH7表达；⑤分子机制研究：Western blot检测蛋白表达、免疫共沉淀（Co-IP）检测蛋白相互作用、CHX chase实验检测蛋白稳定性、MG132/CQ处理鉴定降解途径、体外琥珀酰化实验验证琥珀酰化修饰；⑥线粒体功能评估：透射电子显微镜观察线粒体形态、Mito-Tracker Red染色、JC-1染色检测线粒体膜电位、Calcein-AM检测线粒体通透性转换孔（mPTP）、ATP检测试剂盒测定ATP水平；⑦代谢物检测：ELISA检测甘氨酸、肌氨酸、琥珀酰-CoA和SAM水平，试剂盒检测琥珀酸、苹果酸和ATP含量。
四、研究结果
GNMT/ATP5J2过表达缓解了HF诱导的骨骼肌萎缩
研究人员首先通过GEO数据库筛选HF小鼠和地塞米松（DEX）诱导肌萎缩小鼠转录组数据集的差异表达基因，发现DDR1、NNMT、ATP5J2和GNMT四个基因在两种模型中均差异表达。在AAC诱导的HF大鼠模型中，GNMT和ATP5J2的mRNA和蛋白水平均显著下调。过表达GNMT或ATP5J2后，HF大鼠的左心室舒张末期内径（LVIDd）和收缩末期内径（LVIDs）降低，左心室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（LVFS）升高，血清NT-proBNP水平显著下降，心肌组织病理损伤改善，腓肠肌肌纤维间距减小。Western blot结果显示，过表达GNMT或ATP5J2可降低肌萎缩标志物MAFbx和MuRF1的表达，升高肌形成因子MyoD的表达。进一步研究发现，GNMT过表达不影响ATP5J2的mRNA水平但显著提高其蛋白水平，而ATP5J2过表达不影响GNMT的表达。在GNMT过表达的HF大鼠中敲低ATP5J2后，肌纤维间距增加，抓力和运动能力下降，MYH1和MYH7表达被抑制。以上结果表明GNMT通过ATP5J2缓解HF诱导的骨骼肌萎缩。
ATP5J2对GNMT调控线粒体稳态至关重要
研究人员在Ang Ⅱ处理的C2C12细胞中单独转染OE-GNMT或联合转染shATP5J2。透射电镜结果显示，GNMT过表达保持了线粒体的正常形态，而同时敲低ATP5J2后线粒体肿胀、嵴消失。Mito-Tracker Red染色显示shATP5J2导致OE-GNMT细胞中线粒体分布和形态异常。JC-1染色结果显示敲低ATP5J2后线粒体膜电位下降。Calcein-AM荧光染色显示敲低ATP5J2显著降低了OE-GNMT细胞的mPTP开放程度。ATP检测结果显示敲低ATP5J2显著降低了OE-GNMT细胞中的ATP浓度。Western blot结果显示敲低ATP5J2后线粒体分裂蛋白DRP1和Fis-1表达显著上调。以上结果表明ATP5J2在GNMT维持线粒体稳态和功能中发挥关键作用。
GNMT通过催化甘氨酸的活性影响琥珀酰-CoA水平
研究人员通过ELISA实验验证了GNMT的功能：GNMT过表达细胞中甘氨酸水平显著降低，肌氨酸水平显著升高；琥珀酸和苹果酸含量在GNMT过表达后显著增加。用100 mM甘氨酸处理GNMT过表达细胞后，细胞内琥珀酰-CoA水平显著降低。研究人员从RCSB PDB网站获取GNMT的三维结构（1XVA），发现GNMT第30位的色氨酸（TRP，W）与甘氨酸竞争性抑制剂乙酸（Ac）结合。将GNMT第30位色氨酸突变为苯丙氨酸（Phe，F）后，GNMT W30F升高了细胞内甘氨酸水平，显著降低了肌氨酸水平，但对SAM含量无影响，同时显著降低了琥珀酰-CoA含量。以上结果表明GNMT依赖其催化甘氨酸的活性来补充细胞内的琥珀酰-CoA。
GNMT通过催化甘氨酸调控ATP5J2的琥珀酰化
GNMT过表达显著提高了细胞内蛋白质的整体琥珀酰化水平。体外琥珀酰化实验显示，随着琥珀酰-CoA浓度增加，ATP5J2的琥珀酰化水平上调。GNMT过表达可促进ATP5J2的琥珀酰化。CHX chase实验显示，GNMT过表达细胞中ATP5J2蛋白的稳定性逐渐提高。MG132（蛋白酶体抑制剂）可挽救ATP5J2蛋白的降解，而CQ（溶酶体抑制剂）无此作用，表明ATP5J2主要通过蛋白酶体途径降解。GNMT过表达降低了ATP5J2的泛素化水平。用100 mM甘氨酸处理OE-GNMT细胞后，ATP5J2蛋白水平下降，琥珀酰化水平降低，泛素化水平显著升高。与Myc-GNMT WT相比，Myc-GNMT W30F显著抑制了ATP5J2的琥珀酰化并降低了其蛋白稳定性。以上结果表明GNMT通过其催化甘氨酸的活性增强ATP5J2的琥珀酰化修饰。
CPT1A介导ATP5J2的琥珀酰化
研究人员从四种已报道的琥珀酰化调控因子（CPT1A、KAT2A、SIRT5和SIRT7）中筛选ATP5J2的琥珀酰化酶，Co-IP结果显示仅CPT1A与ATP5J2存在相互作用。分子对接结果也显示CPT1A与ATP5J2蛋白结构之间存在强相互作用。免疫荧光和Western blot结果均表明CPT1A和ATP5J2共定位于线粒体。在HF大鼠模型中，CPT1A在腓肠肌组织中的表达显著下调。过表达CPT1A后ATP5J2蛋白水平显著升高，而使用CPT1A抑制剂马来酸哌克昔林（PEM）处理后ATP5J2蛋白水平随浓度增加而下降。CPT1A过表达提高了ATP5J2的琥珀酰化水平，降低了其泛素化水平，而PEM则升高了ATP5J2的泛素化水平。研究人员合成了CPT1A的两个突变体：H473A（缺乏琥珀酰转移酶活性）和G710E（保留琥珀酰转移酶活性）。结果显示CPT1A WT和G710E均显著提高ATP5J2蛋白水平，而H473A降低了ATP5J2蛋白水平。体外实验证实CPT1A WT和G710E增强了ATP5J2的琥珀酰化，表明CPT1A是ATP5J2的琥珀酰转移酶。此外，CPT1A WT和G710E促进了MYH1的表达并增加了细胞内ATP含量，而H473A则显著抑制了这些效应。
ATP5J2 K22位点的琥珀酰化增强线粒体稳态并抑制骨骼肌萎缩
研究人员通过pSuc-PseRat在线网站预测ATP5J2的潜在琥珀酰化位点，其中预测置信度最高的三个位点为K17、K22和K86。将K17、K22和K86位点的ATP5J2突变体转染至细胞中，结果显示仅当K22突变为精氨酸（Arg）时ATP5J2的琥珀酰化水平降低。K22位点在多个物种中高度保守。体外琥珀酰化结果进一步表明K22R降低了ATP5J2的琥珀酰化水平，且HA-CPT1A过表达无法逆转K22R对ATP5J2琥珀酰化的抑制作用。将K22位点突变为谷氨酸（Glu，E）以模拟琥珀酰化功能。结果显示，与Flag-ATP5J2 WT和K22E相比，K22R显著降低了ATP5J2的蛋白稳定性并提高了其泛素化水平。免疫荧光和Western blot分析显示，K22E突变增强了MYH1和MYH7的表达并降低了MAFbx和MuRF1的蛋白水平，而K22R突变则产生相反效应。与K22E突变相比，K22R突变破坏了细胞线粒体形态，降低了线粒体膜电位，导致细胞内ATP含量下降。以上结果表明ATP5J2 K22位点的琥珀酰化增强线粒体稳态并抑制骨骼肌萎缩。
运动有效缓解GNMT过表达大鼠的骨骼肌萎缩
研究人员对GNMT过表达的HF大鼠实施适度运动干预。HE染色结果显示，与OE-GNMT组相比，运动干预后腓肠肌纤维结构显著改善。Western blot结果显示运动干预进一步增强了OE-GNMT的效果，表现为MAFbx和MuRF1表达降低、MyoD表达升高。免疫荧光结果显示运动干预后MYH1和MYH7表达升高。ELISA结果显示运动干预进一步提高了OE-GNMT大鼠的琥珀酸水平。Co-IP结果显示运动干预后ATP5J2的琥珀酰化水平显著升高，其蛋白表达也显著增强。
五、讨论与结论
讨论部分指出，HF是一种复杂的多系统临床综合征，骨骼肌萎缩患者常表现为骨骼肌结构、代谢和功能异常，其中线粒体功能障碍在HF患者骨骼肌萎缩中发挥核心作用。GNMT通过催化甘氨酸转化为肌氨酸，维持SAM/SAH比值的恒定。本研究发现GNMT在HF大鼠腓肠肌和Ang Ⅱ诱导的细胞模型中低表达，过表达GNMT可增强骨骼肌萎缩细胞的线粒体功能并维持其稳态。ATP5J2主要定位于线粒体嵴边缘，其下调会导致嵴组织异常和线粒体膜通透性降低。本研究发现GNMT作为ATP5J2的上游调控因子，通过影响其蛋白水平而非mRNA水平发挥作用。GNMT通过催化甘氨酸防止琥珀酰-CoA经血红素合成途径被消耗，从而维持琥珀酰-CoA水平。琥珀酰-CoA作为蛋白质琥珀酰化的主要底物，GNMT通过影响琥珀酰-CoA水平增强ATP5J2在K22位点的琥珀酰化，抑制其泛素化降解。CPT1A作为ATP5J2的琥珀酰转移酶，其琥珀酰转移酶活性对骨骼肌萎缩至关重要。关于CPT1A（外膜蛋白）与ATP5J2（内膜/嵴蛋白）的物理互作机制，研究人员推测可能发生在线粒体接触位点，或CPT1A可能存在非典型定位。运动疗法是目前对抗肌肉萎缩最常用且有效的治疗手段，适度运动通过促进肌肉释放琥珀酸，上调ATP5J2琥珀酰化水平，协同缓解骨骼肌萎缩。
结论：研究人员发现GNMT/ATP5J2的过表达可通过调控线粒体稳态缓解HF诱导的骨骼肌萎缩。机制上，GNMT通过催化甘氨酸恢复琥珀酰-CoA水平，从而调控CPT1A介导的ATP5J2琥珀酰化。ATP5J2的琥珀酰化有利于维持细胞内线粒体的结构和功能。此外，GNMT过表达大鼠运动后体内琥珀酸水平升高，进一步增强ATP5J2的琥珀酰化。该研究为HF诱导的骨骼肌萎缩提供了新的见解和治疗途径。
