血小板衍生微粒通过递送miR-550a-5p诱导慢性肾脏病CD8+ T细胞衰老

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：Platelet-derived microparticles induce CD8+ T cell senescence in chronic kidney disease via the transfer of microRNA-550a-5p

　　

感染是慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）患者死亡的主要原因，其中T细胞功能障碍被认为是典型特征。尽管血小板是免疫应答的活跃参与者，但其在调节CKD患者T细胞功能中的作用仍不清楚。在本研究中，研究人员证明CD8⁺ T细胞衰老可能是CKD患者免疫抑制状态的主要促进因素，来源于CKD患者的血小板可诱导CD8⁺ T细胞过早衰老，可能通过介导线粒体功能障碍实现。进一步研究揭示，来源于CKD患者的血小板衍生微粒（platelet-derived microparticles, PMPs）通过转移miR-550a-5p促进CD8⁺ T细胞衰老，从而降低肽酶-线粒体加工亚基β（peptidase-mitochondrial processing subunit beta, PMPCB）表达并诱导NADH:泛醌氧化还原酶核心亚基S8（NADH:ubiquinone oxidoreductase core subunit S8, NDUFS8）裂解失败。最后，抑制miR-550a-5p和烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide, NMN）预处理能够预防CKD患者中血小板诱导的CD8⁺ T细胞衰老。总之，这些发现表明，血小板来源的miR-550a-5p在CD8⁺ T细胞中的异位瞬时表达通过调控PMPCB–NDUFS8轴促进细胞衰老，这可被用于治疗CKD相关免疫衰老（immunosenescence）。

慢性肾脏病（CKD）已成为全球公共卫生问题，并伴随多种并发症高发。感染是CKD患者发病和死亡的首要原因，尤其终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）患者。CKD患者的免疫抑制状态以固有免疫和适应性免疫系统功能障碍为特征，导致促炎环境和细胞免疫下降。T细胞是适应性免疫的主要细胞成分，负责介导细胞免疫应答。在CKD中，循环T细胞总数和功能发生深刻变化。既往研究，包括研究人员自身工作，已显示CKD中T细胞数量下降，终末分化和促炎T细胞增加。在尿毒症、透析等众多刺激下，T细胞复制能力受损，导致功能耗竭和衰老。耗竭以PD-1、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）等抑制性受体表达升高为标志；衰老则以端粒缩短、CD28丢失和CD57表达为特征。然而，T细胞耗竭和衰老导致CKD免疫功能障碍的机制仍 largely未明。血小板不仅参与止血和血栓形成，还可主动调节免疫应答，释放颗粒和微粒调节适应性免疫。研究人员此前发现CKD环境中血小板稳态紊乱，血小板–免疫细胞相互作用增强，PMPs释放增加。鉴于血浆微粒可改变T细胞功能和表型，且PMPs是血液中最丰富的微粒，研究人员开展本研究，旨在阐明血小板–T细胞相互作用在CKD免疫失调中的作用。研究证明，CKD患者血小板通过释放PMPs转移miR-550a-5p，经PMPCB–NDUFS8轴诱导线粒体功能障碍介导的CD8⁺ T细胞衰老。该研究揭示了一种新的血小板–CD8⁺ T细胞相互作用，并为预防CKD中CD8⁺ T细胞衰老提供了潜在策略。论文发表在《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》。

关键技术方法概述：研究队列来自新桥医院肾内科，纳入75例非透析CKD 3–5期患者（25–45岁）和45名健康志愿者；表型分析纳入30例CKD 3–5期患者与30名健康对照，衰老程度分析另纳入45例CKD 3–5期患者与15名健康对照，机制分析主要使用30例CKD 5期患者与30名健康对照，排除继发性肾病、糖尿病、近期免疫抑制剂使用、任何病因感染及CMV血清阳性者。动物实验采用C57BL/6J小鼠，尾静脉注射miR-550a-5p agomir或阴性对照，或注射DiO-PMPs。公共外周血单个核细胞单细胞RNA测序数据集GSE233315用于再分析。关键技术包括CD8⁺ T细胞、血小板及PMPs分离与共培养，流式细胞术和分选，相对端粒长度qPCR，Seahorse线粒体应激测试，NAD⁺/NADH检测，miRNA表达谱，双荧光素酶报告，Western blot、免疫共沉淀、免疫荧光及生物信息学分析。

研究结果：
外周血CD8⁺ T细胞在慢性肾脏病患者中发生过早衰老（Peripheral blood CD8⁺ T cells develop premature senescence in patients with chronic kidney disease）。通过再分析GSE233315单细胞RNA测序数据，研究人员发现T细胞耗竭标志PDCD1和CTLA-4在健康对照与ESRD患者间相当，而KEGG显示细胞衰老评分显著上调，尤其CD8⁺ T效应细胞。流式细胞术显示CKD 3–5期患者CD4⁺和CD8⁺ T细胞中PD-1轻度增加；CD57在CD4⁺ T细胞中无显著差异，但在CD8⁺ T细胞中显著升高，且随CKD进展而增加，CKD 5期最显著。CD28^?CD57⁺细胞比例在CD8⁺ T细胞中显著增加，而CD4⁺ T细胞中无显著差异。结论提示，CD8⁺ T细胞过早衰老可能是CKD患者T细胞免疫无能的中心贡献因素。

CD8⁺ T细胞在慢性肾脏病中衰老生物标志物上调并伴线粒体功能障碍（CD8⁺ T cells exhibit upregulated senescence biomarkers accompanied by mitochondrial dysfunction in chronic kidney disease）。免疫荧光和Western blot显示CKD患者CD8⁺ T细胞中DNA损伤标志γ-H2A.X和细胞周期抑制因子p21显著升高；流式检测显示衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性增加，qPCR显示衰老促炎细胞因子TNF和IFNγ表达升高；相对端粒长度分析显示CKD患者端粒显著缩短。Seahorse分析显示氧消耗速率（OCR）、最大呼吸能力和ATP产生下降；TMRM检测显示线粒体膜电位丢失，ROS产生增加。结论表明CKD患者CD8⁺ T细胞呈现全面衰老表型并伴严重线粒体功能障碍。

慢性肾脏病患者血小板通过介导线粒体功能障碍诱导CD8⁺ T细胞过早衰老（Platelets from patients with chronic kidney disease induce premature CD8⁺ T cell senescence by mediating mitochondrial dysfunction）。研究人员建立健康供者或CKD患者血小板与健康供者CD8⁺ T细胞共培养体系。单独培养或与健康人血小板共培养的CD8⁺ T细胞未出现衰老表型；与CKD患者血小板共培养后，第5天出现γ-H2A.X、p21、SA-β-Gal和CD57显著上调，促炎细胞因子升高和端粒缩短。第3天即观察到线粒体膜电位下降、呼吸功能受损和ROS过量产生，早于衰老表型；N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理可有效阻止线粒体功能障碍和细胞衰老。结论提示CKD患者血小板可能通过介导线粒体功能障碍启动CD8⁺ T细胞过早衰老。

慢性肾脏病患者血小板衍生微粒介导CD8⁺ T细胞线粒体功能障碍和细胞衰老（Platelet-derived microparticles from patients with chronic kidney disease mediate mitochondrial dysfunction and cellular senescence in CD8⁺ T cells）。研究人员证实CKD患者血小板活性增强，P-selectin、活化GPIIb/IIIa表达和PMP释放增加。PMP释放与CD8⁺ T细胞衰老标志和ROS水平正相关，与线粒体膜电位负相关。分离PMPs后，DiO标记PMPs可被CD8⁺ T细胞内化；小鼠尾静脉注射后，外周血CD8⁺ T细胞中检测到DiO阳性信号。CKD来源PMPs显著诱导CD8⁺ T细胞线粒体功能障碍和衰老，NAC可缓解。CKD来源PMPs不显著影响CD8⁺ T细胞增殖，也不加重CD57⁺CD8⁺ T细胞衰老，而主要促进CD57^?CD8⁺ T细胞向CD57⁺衰老表型转变。结论表明PMPs直接作用于CD8⁺ T细胞，通过诱导线粒体功能障碍促进过早衰老。

血小板衍生微粒以miR-550a-5p依赖方式促进CD8⁺ T细胞过早衰老（Platelet-derived microparticles promote premature CD8⁺ T cell senescence in an miR-550a-5p-dependent manner）。miRNA表达谱显示CKD来源PMPs中109个miRNA上调和57个下调，miR-550a-5p为最显著上调者之一。miRNA模拟物筛选显示，仅miR-550a-5p显著增加SA-β-Gal阳性、γ-H2A.X和p21表达。CD8⁺ T细胞中miR-550a-5p含量低于PMPs，但CKD患者CD8⁺ T细胞中高于健康对照，提示PMPs中miR-550a-5p被转移至CD8⁺ T细胞；共培养体系亦观察到该现象。MEG-01细胞中仅CKD血清而非PBMCs显著升高miR-550a-5p，提示可溶性因素驱动其上调。miR-550a-5p过表达诱导其他衰老表型和线粒体功能障碍，主要促进CD57^?向CD57⁺转化；miR-550a-5p抑制剂可挽救CKD患者血小板共培养诱导的效应。结论表明CKD来源PMPs通过miR-550a-5p介导的线粒体功能障碍轴诱导CD8⁺ T细胞衰老。

MiR-550a-5p通过靶向PMPCB诱导CD8⁺ T细胞线粒体功能障碍和细胞衰老（MiR-550a-5p induces mitochondrial dysfunction and cellular senescence in CD8⁺ T cells via targeting PMPCB）。生物信息学分析预测19个潜在线粒体靶基因，GO富集显示线粒体蛋白转运显著富集。CKD患者CD8⁺ T细胞中PMPCB mRNA和蛋白水平显著下降，miR-550a-5p模拟物转染选择性降低PMPCB水平；CKD血小板共培养也降低PMPCB表达。双荧光素酶报告实验证实miR-550a-5p过表达降低野生型而非突变型PMPCB 3’UTR报告活性。小鼠PMPCB 3’UTR亦存在miR-550a-5p结合位点；miR-550a-5p agomir处理小鼠CD8⁺ T细胞出现衰老、线粒体功能障碍和PMPCB下调。结论表明miR-550a-5p可直接结合并下调PMPCB表达。

敲低PMPCB诱导CD8⁺ T细胞线粒体功能障碍和细胞衰老（Knockdown of PMPCB induces mitochondrial dysfunction and cellular senescence in CD8⁺ T cells）。转染PMPCB特异性siRNA后，CD8⁺ T细胞线粒体膜电位下降、呼吸功能受损、ROS水平升高，衰老生物标志物、促炎细胞因子上调和端粒缩短；PMPCB过表达可缓解miR-550a-5p诱导的线粒体功能障碍和细胞衰老。结论强调PMPCB在维持CD8⁺ T细胞线粒体稳态中的关键作用。

烟酰胺单核苷酸抵消慢性肾脏病患者血小板诱导和NDUFS8介导的CD8⁺ T细胞衰老（Nicotinamide mononucleotide counteracts platelets from patients with chronic kidney disease-induced and NDUFS8-mediated cellular senescence in CD8⁺ T cells）。通过蛋白–蛋白相互作用分析，研究人员发现PMPCB与NDUFS8相互作用。CKD患者CD8⁺ T细胞中NDUFS8总表达无显著差异，但出现前体和成熟形式，健康对照仅存在成熟形式；CKD血小板共培养或miR-550a-5p模拟物/agomir处理诱导NDUFS8裂解失败，PMPCB过表达可缓解。免疫共沉淀证实PMPCB与NDUFS8互作。CKD患者CD8⁺ T细胞中NAD⁺水平和NAD⁺/NADH比值下降，PMPCB过表达部分改善。NMN处理有效减轻CD8⁺ T细胞线粒体功能障碍，防止CKD患者血小板诱导的细胞衰老；小鼠中NMN腹腔注射亦缓解miR-550a-5p agomir诱导的线粒体功能障碍和衰老。结论提示NMN可能作为缓解CKD患者血小板介导线粒体功能障碍和细胞衰老的有前景治疗药物。

讨论部分总结：感染是CKD患者发病和死亡的首要原因，T细胞活化显著影响免疫功能和感染易感性。尽管CKD中T细胞稳态紊乱已被广泛研究，其功能障碍机制仍存在知识缺口。本研究识别CD8⁺ T细胞过早衰老是CKD T细胞稳态改变的关键特征，并证明血小板通过转移含miR-550a-5p的PMPs进入CD8⁺ T细胞，下调PMPCB并抑制NDUFS8/NAD⁺轴，从而加速衰老；抑制miR-550a-5p或过表达PMPCB可改善此过程。CKD患者易发生早发年龄相关疾病，免疫衰老促进感染、肿瘤、自身免疫病及心脑血管、代谢、非酒精性脂肪肝和神经退行性疾病。研究纳入非透析患者并排除CMV血清阳性者，观察到CD8⁺ T细胞衰老随CKD进展而发展。血小板除止血外，也是固有免疫细胞成分，可通过释放颗粒或微粒调节免疫；研究通过流式门控策略排除了直接受体相互作用，并证实PMP释放增加且与CD8⁺ T细胞衰老正相关。血小板释放颗粒与细胞衰老的关系在不同环境中表现不一致，而本研究发现miR-550a-5p在CKD来源PMPs中显著上调并加速CD8⁺ T细胞衰老；该miRNA也与癌细胞增殖和迁移相关，可能通过介导CD8⁺ T细胞衰老和免疫抑制参与其中。尿毒症环境驱动PMPs中miR-550a-5p上调，但具体毒素尚不明确。抗血小板药物如阿司匹林具有抗衰老特性，提示抗血小板策略可能有助于缓解CD8⁺ T细胞衰老。线粒体功能障碍和相关ROS产生参与衰老及多种衰老相关病理状态。本研究中，CKD血小板共培养后CD8⁺ T细胞线粒体紊乱早于衰老表型，NAC处理可挽救，提示血小板可能通过介导线粒体功能障碍诱导衰老。研究人员首次通过生物信息学和双荧光素酶报告分析鉴定PMPCB为miR-550a-5p靶基因。PMPCB是线粒体加工肽酶的催化亚基，减少或突变会导致加工中间体积累；PMPCB缺失可损害pro-NDUFS8成熟，降低NAD⁺/NADH比值。NDUFS8是线粒体复合物I核编码核心亚基，其缺陷会降低NAD⁺/NADH比值和线粒体膜电位。细胞内NAD⁺降低与衰老密切相关，NMN处理可减轻CD8⁺ T细胞线粒体功能障碍和细胞衰老。因此，靶向PMPCB–NDUFS8轴可能为改善CD8⁺ T细胞衰老和免疫功能提供新机会。

研究结论部分翻译：总之，这些发现表明，在CKD中，血小板来源的miR-550a-5p通过PMPCB–NDUFS8轴导致CD8⁺ T细胞衰老。该研究为PMP介导的免疫–血小板相互作用提供了新见解，并提供了预防CKD中CD8⁺ T细胞衰老的潜在策略，而其对这些细胞其他类型的影响仍有待探索。