《Journal of Plant Pathology》：Untargeted metabolomic profiling of sweet potato latent virus infected Nicotiana benthamiana
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摘要：病毒病害是第二大生物胁迫因素，导致甘薯严重减产和品质下降，而甘薯潜隐病毒（sweet potato latent virus, SPLV）是中国甘薯的主要病毒病原体之一。为探究SPLV诱导的代谢变化，研究人员采用非靶向液相色谱-质谱联用技术（liquid
摘要：病毒病害是第二大生物胁迫因素，导致甘薯严重减产和品质下降，而甘薯潜隐病毒（sweet potato latent virus, SPLV）是中国甘薯的主要病毒病原体之一。为探究SPLV诱导的代谢变化，研究人员采用非靶向液相色谱-质谱联用技术（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）分析了经SPLV感染的甘薯叶片汁液接种的本氏烟（Nicotiana benthamiana）。主成分分析（principal component analysis, PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA）证实，感染植株与模拟对照植株之间存在显著的代谢物谱差异。在SPLV感染植株中，共有626种代谢物表现出显著差异积累，其中429种上调，197种下调。这些差异代谢物被归入14个不同的生化类别，层次聚类分析直观展示了排名前50位最显著差异代谢物的表达模式。此外，京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析揭示，SPLV接种后19条通路发生了显著扰动。这些结果证实了SPLV对本氏烟代谢具有显著影响，有助于阐明SPLV-宿主互作机制，并为增强甘薯对SPLV的抗性提供了候选代谢靶点。
一、研究背景
甘薯（Ipomoea batatas）是全球重要的块根块茎作物，作为人类主食、动物饲料和可再生生物能源原料。然而，病毒病害引发严重的产量损失和品质退化，是仅次于虫害的第二大破坏性生物胁迫因素。全球已有超过30种病毒被报道可感染甘薯，其中甘薯潜隐病毒（sweet potato latent virus, SPLV）、甘薯羽状斑驳病毒（sweet potato feathery mottle virus, SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（sweet potato chlorotic fleck virus, SPCFV）是中国甘薯上最流行且危害最大的病毒种类。SPLV属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），其编码一个大聚蛋白，切割后产生10个推定成熟蛋白，可通过机械接种侵染本氏烟（Nicotiana benthamiana）。
代谢组学作为一种强大的分析技术，已被广泛应用于研究植物对生物或非生物胁迫的代谢响应。尽管在动物病毒领域已有大量关于病毒-代谢网络的研究，但关于植物病毒重塑宿主代谢组的探索仍相对有限。现有证据表明，一些病毒在植物代谢物修饰中发挥关键作用，例如番茄花叶病毒（tomato mosaic virus, ToMV）感染导致番茄叶片氨基酸和有机酸水平升高，芜菁花叶病毒（turnip mosaic virus, TuMV）抑制芸薹属植物挥发性有机物合成等。鉴于对SPLV影响植物代谢的了解尚不充分，本研究旨在通过非靶向液相色谱-质谱联用技术（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）探索SPLV感染下本氏烟的代谢变化，揭示SPLV-宿主互作的代谢机制，并鉴定潜在靶点以增强植物抗性或减轻病毒对甘薯生产的不利影响。
二、主要关键技术方法
研究人员从中国山东临沂（36°13'N, 118°24'E）采集SPLV感染的甘薯症状组织，于2021年9月获取样本。将1克感染组织在冰浴0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中匀浆制备汁液接种物，摩擦接种5–6叶期的本氏烟三片完全展开叶片，同时以无菌磷酸盐缓冲液摩擦接种作为模拟对照。接种后第5天开始出现病毒症状，第10天系统感染率达100%。随后收集SPLV接种和模拟接种的本氏烟叶片样品，加入内标L-2-氯苯丙氨酸后进行甲醇-水提取、超声辅助萃取、离心过滤等预处理。采用Progenesis QI V2.3软件处理LC-MS数据，基于精确质荷比（m/z）、二级碎片图谱和同位素分布，参照人类代谢组数据库（Human Metabolome Database, HMDB）、Lipidmaps（V2.3）、Metlin等多个数据库进行化合物鉴定。数据矩阵导入R软件进行多变量统计分析，包括主成分分析（principal component analysis, PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA），并通过七折交叉验证和200次响应置换检验评估模型可靠性。差异代谢物筛选标准为OPLS-DA模型中变量投影重要性（variable importance in the projection, VIP）>1且Student's t检验p值<0.05。利用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）数据库对差异代谢物进行通路注释和富集分析。
三、研究结果
1. 多元统计分析揭示SPLV感染引起代谢谱显著变化
非靶向LC-MS分析比较了SPLV感染与模拟感染本氏烟的代谢组学特征。PCA分析显示两组样品在Hotelling's T2椭圆95%置信区间内明显分离，表明代谢物组成存在显著差异，验证了样本适用于后续差异分析。进一步构建的OPLS-DA判别模型显示，模拟感染植株聚集在x轴右侧，感染植株聚集在左侧，两组间差异显著。七折交叉验证和200次响应置换检验证明该模型可靠且未出现过拟合。
2. 差异代谢物鉴定与分类
共检测到8,175种代谢物，去除外源化合物后，根据VIP>1和p<0.05筛选出626种差异表达代谢物，其中429种上调、197种下调。这些差异代谢物被归入14个不同的生化类别，脂类及类脂分子所占比例最大。对按VIP排序的前50种最显著差异代谢物进行层次聚类分析，结果显示SPLV感染植株中某些代谢物特征的丰度相对于模拟感染样品更高。
3. KEGG通路富集分析
对626种差异代谢物进行KEGG通路富集分析，以p≤0.05为阈值，共显著富集19条通路，包括：嘧啶代谢（pyrimidine metabolism, KEGG: dme00240）、β-丙氨酸代谢（beta-Alanine metabolism, KEGG: dme00410）、氨酰-tRNA生物合成（aminoacyl-tRNA biosynthesis, KEGG: dme00970）、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism, KEGG: dme00250）、泛酸和辅酶A生物合成（pantothenate and CoA biosynthesis, KEGG: dme00770）、ABC转运蛋白（ABC transporters, KEGG: dme02010）、柠檬酸循环（TCA循环）（citrate cycle (TCA cycle), KEGG: dme00020）、氰基氨基酸代谢（cyanoamino acid metabolism, KEGG: dme00460）、赖氨酸降解（lysine degradation, KEGG: dme00310）、乙醛酸和二羧酸代谢（glyoxylate and dicarboxylate metabolism, KEGG: dme00630）、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成（valine, leucine and isoleucine biosynthesis, KEGG: dme00290）、光合生物碳固定（carbon fixation in photosynthetic organisms, KEGG: dme00710）、鞘脂代谢（sphingolipid metabolism, KEGG: dme00600）、丙酮酸代谢（pyruvate metabolism, KEGG: dme00620）、苯丙氨酸代谢（phenylalanine metabolism, KEGG: dme00360）、嘌呤代谢（purine metabolism, KEGG: dme00230）、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解（valine, leucine and isoleucine degradation, KEGG: dme00290）、萜类骨架生物合成（terpenoid backbone biosynthesis, KEGG: dme00900）和半乳糖代谢（galactose metabolism, KEGG: dme00052）。其中，含有超过6种差异代谢物的通路包括嘧啶代谢、β-丙氨酸代谢、氨酰-tRNA生物合成和ABC转运蛋白。在氨酰-tRNA生物合成、氰基氨基酸代谢和鞘脂代谢通路中，所有差异代谢物均上调；相反，注释到丙酮酸代谢的所有差异代谢物均显著下调。
四、总结讨论
已知病毒通过重新编程宿主细胞代谢来重塑核心生理过程，从而建立成功感染。先前研究已鉴定出多条在启动植物抗病毒或促进病毒成功中发挥关键作用的代谢通路。本研究中，PCA和OPLS-DA分析揭示了SPLV感染与模拟感染本氏烟之间代谢物组成的显著差异，层次聚类分析也证实感染样品中某些代谢物丰度显著高于模拟对照。通过KEGG分析鉴定的19条显著扰动通路与其它病毒感染中已报道的变化高度相似。例如，SPLV感染显著富集的TCA循环在马铃薯Y病毒（potato virus Y, PVY）感染中也受到干扰；苯丙氨酸代谢通路在甘蔗花叶病毒（sugarcane mosaic virus, SCMV）和葡萄红斑病毒（grapevine red blotch virus, GRBV）感染中同样发生改变。
五、研究结论
这些发现为探究SPLV-宿主互作提供了新的证据，并有望为鉴定增强植物抗性的靶点或制定缓解SPLV感染不利影响的策略提供潜在思路。
