Thermosynechococcus vestitus 单体光系统I的1.8 ?冷冻电镜结构：C12E8诱导单体化、SQD/βDM环、红移叶绿素丢失与Cyt c6瞬态结合

《Photosynthesis Research》：High-resolution structure of monomeric photosystem I from Thermosynechococcus vestitus

　　

光系统I（PSI）在蓝细菌类囊体膜中以三聚体（tPSI）和单体（mPSI）形式存在。PSI 作为光驱动电子泵，能够将电子从细胞色素 c₆（Cyt c₆）或质体蓝素转移至铁氧还蛋白。在此，研究人员开发了一种新方案，通过在升高的温度下使用去垢剂八乙二醇单十二烷基醚（C₁₂E₈）解离高度纯化的 tPSI，从而从 Thermosynechococcus vestitus（Tv）中获得大量完整、有活性的 mPSI。研究人员采用光谱方法组合，例如 77 K 荧光和圆二色性（CD），分析蛋白-去垢剂复合物的稳定性，并研究去垢剂对去脂化和单体化的影响。研究人员使用冷冻电镜（cryo-EM）将 mPSI 结构解析至 1.8 ? 分辨率。该结构保留除 PsaL 外的所有亚基，并鉴定出一个硫代异鼠李糖基二酰甘油（SQD）分子和 16 个 n-dodecyl β-maltoside（βDM）分子围绕复合物排列成环。通过应用小角中子散射（SANS），在生理温度下于溶液中验证了 mPSI 结构。比较 mPSI 与 tPSI 的辅因子清单，研究人员提出对一个红移叶绿素色素的归属，并讨论去垢剂和脂质对 PSI 稳定性及寡聚状态的影响。最后，在还原条件下加入天然 Tv Cyt c₆ 时，在 P₇₀₀ 色素附近观察到额外密度，表明存在瞬态结合的 Cyt c₆。

研究背景与问题：光合作用中，蓝细菌、藻类和高等植物通过光系统I（PSI）和光系统II（PSII）将太阳能转化为化学能。PSI 驱动电子从还原态质体蓝素（Pc）或细胞色素 c₆（Cyt c₆）传递至氧化态铁氧还蛋白（Fd）。在类囊体膜中，PSI 以三聚体（tPSI）和单体（mPSI）存在。已有大量 tPSI X 射线结构，但 Tv 仅有 ?oruh et al. 的 mPSI 结构 6LU1，分辨率 3.2 ?，保留 PsaL 但缺失 PsaK、PsaX，PsaF/PsaJ 仅部分建模，并缺失 14 个叶绿素 a（Chl a）、1 个脂质和 4 个类胡萝卜素。mPSI 制备中红移叶绿素（red Chls）常丢失，红 Chls 功能不清；Cyt c₆ 与 PSI 的结合为瞬态、占据低，蓝细菌 PSI-Cyt c₆ 结合位点尚未完全阐明；去垢剂和脂质对 PSI 稳定性和寡聚态的作用也不清楚。因此研究人员开发新方案获得大量完整活性 mPSI，解析高分辨率结构并研究单体化、辅因子丢失和 Cyt c₆ 结合。

关键技术方法：研究人员以 Thermosynechococcus vestitus BP1 为样本来源，分离纯化 tPSI 并预结晶。通过添加 1% C₁₂E₈、60 °C 孵育使 tPSI 单体化，经蔗糖梯度分离 mPSI。表征包括 Blue Native PAGE、动态光散射（DLS）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）、体积排阻色谱（SEC）、Clark 型电极测 O₂ 消耗活性、圆二色性（CD）、室温 UV-Vis、77 K 荧光、冷冻电镜（cryo-EM）及小角中子散射（SANS）。SANS 中使用氘代 βDM 抑制去垢剂胶束散射。

研究结果：
Generation of functional monomeric PSI：通过 BN-PAGE、DLS、MALDI-ToF、SEC 确认预结晶 tPSI 高均一、单分散且含 12 个亚基；βDM tPSI 加 1% C₁₂E₈ 60 °C 30 min 几乎全部生成 mPSI，C₁₂E₈ tPSI 10 min 即可；mPSI 缺失 PsaL，O₂ 活性与 tPSI 类似。
βDM mPSI cryo-EM structure：用 cryo-EM 获得 1.8 ? 结构，含 11 个蛋白亚基，PsaL 缺失；含 1183 个水、19 个 β-胡萝卜素（β-Car）、91 个 Chl a、7 个脂质、16 个 βDM、2 个叶绿醌（PQN）、3 个铁硫簇（FeS）和 1 个 Mg²⁺；可区分 P₇₀₀ 中 Chl a 与 Chl a′。
Resolution, B-factor and ETC：分辨率整体均匀，胞质和腔侧稍好；PsaK 和部分辅因子/残基柔性高；电子传递链（ETC）中 A1-B2 与 B1-A2 距离在单体中更相似；tPSI 中 A 支更柔，mPSI 两支等刚；铁硫簇由内向外柔性增加，F_B 最柔；A2/B2 匹配 0.3 ?，A3/B3 Mg²⁺ 移 0.8 ?，PQN 环移 1.4–1.7 ?。
Carotenoids：与 7FIX 相比，mPSI 缺失 6 个 β-Car：PsaA BCR-855、PsaI BCR-102/103、PsaL BCR-1005/1006/1011，占 24%；完整建模 PsaK BCR-103 和 PsaB BCR-803；PsaA BCR-842 的 β-紫罗兰酮环方向类似 1JB0 而非 7FIX。
Lipid and detergent molecules：鉴定 7 个整合脂质：5 个磷脂酰甘油（PG；PDB 命名 LHG）、1 个单半乳糖基二酰甘油（MGDG；PDB 命名 LMG）、1 个新 SQD（PsaX SQD-101）；16 个 βDM 形成围绕跨膜区的“假脂双层”，上下层 17.6–24.3 ?；SQD-101 由五个氨基酸残基和一个 βDM 配位。
Water molecules：共 1183 个水，为 mPSI 中最多；61% 与 1JB0 在 0.5 ? 内相似，18% 与 6TRA，0% 与 6LU1，40% 与 7FIX，37% 与 5OY0；多数水在膜外，40–60 个在膜区，15 个配位 Chl Mg²⁺；P₇₀₀ 附近水与 1JB0 类似；A2/B2 各由一水配位，11 个水位于 PQN 与 F_X 之间。
Ca²⁺/Mg²⁺ – binding sites：缺失 PsaL 及其 Ca²⁺；在第二 Ca²⁺ 位点发现 Mg²⁺，由 PsaB Glu201、His206 和四个水配位；该位点暴露于无 Ca²⁺ 含 Mg²⁺ 缓冲液；与第一位点距离约 49 ?。
Chlorophyll a：含 91 个 Chl a，比 tPSI 少 5 个（5.2%）；缺失 PsaM 一个、PsaJ 一个、PsaI 一个（近 Ca²⁺ 和 PsaL）及 PsaL 三个；PsaJ 中 CLA-1306 保留，CLA-1307 缺失。
UV-Vis spectroscopy：室温吸收归一化至 630 nm；mPSI 680 nm 峰蓝移至 βDM 678.5 nm、C₁₂E₈ 675.5 nm；708 nm 肩减弱，提示红 Chls 丢失；差谱 400–520 nm 正带提示 β-Car 丢失；模拟支持丢失四个正常 Chls 和一个 710 或 720 nm Chl，且更支持丢失约 710 nm 红 Chls。
Fluorescence spectra：77 K 发射峰 tPSI 为 731–732 nm，mPSI 为 727–730 nm，蓝移较小；不同于 ?oruh et al. 的 720 nm，提示缺失红 Chls 类型不同。
Thermal stability：CD 显示 mPSI 稳定性相似或低于 tPSI；βDM 样品在 0.02% 或 1% βDM 中 T_transition（转变温度）>80 °C；tPSI 在 1% C₁₂E₈ 中约 57–59 °C；C₁₂E₈ mPSI 在 1% βDM 中增至 >65 °C；最高 >90 °C 见于 tPSI 加 1% βDM。
Binding of Cyt c₆ to mPSI：还原条件下加天然 Tv Cyt c₆，cryo-EM 在 mPSI 腔侧 P₇₀₀ 附近观察到额外密度；全局 2.01 ?，该密度局部 5–8 ?，无法建模和局部精修；低占据与弱结合一致。
Solution structures：SANS 使用 dβDM 抑制胶束信号；R_g（回转半径）50.37±0.08 ?，D_max（最大颗粒间距离）155±10 ?，大于 cryo-EM 计算的 40.2 ? 和 131 ?，提示去垢剂交换不完全；拟合显示 cryo-EM 结构描述生理温度溶液状态；加入马心细胞色素 c（Cyt c_HH）后数据向低 Q 移动，R_g/D_max 增加，表明结合；未检测到天然 Cyt c₆ 结合。

讨论总结：研究人员比较已有结构，指出本研究 mPSI 除 PsaL 外保留所有亚基，均一且活性高；缺失 β-Car 比例 24% 超过 Chl a 5.2%；缺失 Chl a 除 PsaJ 外均近 PsaL，可能随 PsaL 脱落。B 因子显示 tPSI A 支更柔而 mPSI 两支等刚；ETC 距离更接近 1JB0/6TRA。第二 Ca²⁺ 位点被 Mg²⁺ 占据，研究人员认为原 Ca²⁺ 弱结合且可被 Mg²⁺ 替换。Cyt c₆ 与 mPSI 为瞬态作用，cryo-EM 仅见额外密度，SANS 显示 Cyt c_HH 可结合而天然 Cyt c₆ 未检测到，与亲和力差异一致。低能 Chls 方面，mPSI 缺失红 Chl B7（B-1207），属于 A31-A32-B6-B7 四聚体，近 PsaL，研究人员将其与 708 nm 吸收关联；719 nm 红 Chls 可能仍存在。去垢剂和脂质方面，C₁₂E₈ 比 βDM 更柔、头基更窄，可进入单体间空间并促进去脂化和单体化；单体间脂质和 SQD 数量可能影响寡聚态。

研究结论部分翻译：研究人员可重复的制备过程通过去垢剂和温度增强单体-单体界面脂质交换，使 tPSI 单体化，获得迄今最高分辨率的单体 PSI 结构，并在 mPSI 中 P₇₀₀ 附近识别结合 Cyt c₆ 的密度。此外，研究人员首次在 Tv PSI 检测到 SQD，在第二 Ca²⁺ 结合位点检测到 Mg²⁺，并将红 Chl B7 与 708 nm 吸收峰关联。该 mPSI 制备方案为后续实验提供框架，例如用 cryo-EM 解析 C₁₂E₈ 纯化 mPSI 以研究去垢剂依赖的结构变化，以及利用天然单体 PSI 的可及性研究单体-单体界面红 Chls。还应制备苯乙烯-马来酸脂质颗粒（SMALP）cryo-EM 结构，以确定无去垢剂时 PSI 与天然脂质的结构。进一步研究红 Chls 结构位置可通过建模结合突变（单 Chl 添加或敲除）并与光谱和红 Chl 位置关联。使用 K?lsch et al. 确定的最佳离子和 pH 条件后，可通过 Cyt c₆ 突变增强其与 PSI 的结合亲和力。研究结果为可靠生成 mPSI 奠定基础，将支持分离结合 Cyt c₆ 的 mPSI 三维分类，预期促进近期鉴定天然非交联 Tv Cyt c₆ 的结合位点。