枯草芽孢杆菌与酿酒酵母间基于α-信息素信号的跨界通讯2.0：人工可控微生物互作的建立

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Interkingdom communication 2.0: pheromone-based control between Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae

　　

自然界中的微生物群落由来源于多个界的生物组成，复杂且和谐共生。因此，它们需要通过群体感应（quorum-sensing）分子进行通讯，以便在近距离内共存。如果能够工程化人工跨界通讯用于生物技术应用，例如在单个发酵罐中利用微生物之间的受控信号传导降解复杂生物材料，将是有益的。为此，研究人员希望建立一个原理验证，即利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的信息素系统，使革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）能够以受控方式与该真核酵母进行通讯。研究人员对B. subtilis进行了基因改造，使其在杆菌肽（bacitracin）诱导后异源产生α-信息素（α-pheromone）；S. cerevisiae识别该信息素后，进而激活绿色荧光蛋白mNeongreen的产生。在改良生长培养基中的共培养以及信息素表达的诱导成功且可重复。酵母的激活和mNeongreen的产生不仅可通过分析检测到，还可通过共培养物的落射荧光显微镜观察到。本研究成功证明了利用微生物天然通讯系统实现微生物间的受控跨界信号传导。

自然界中的微生物群落包含多个生命域的物种，它们依靠群体感应（quorum-sensing, QS，一种微生物密度依赖的信号传导机制）分子进行跨界通讯以维持共存和生态功能。人类肠道微生物组中已鉴定约3000种细菌，菌群失衡与多种疾病相关；微生物相互作用与通讯的分子机制尚不完全清楚，且营养竞争、代谢互养和环境波动都会影响群落稳定性。理解并调控微生物群落的通讯，对于合成生物学（synthetic biology）和绿色生物制造具有重要意义，例如将生产负担分配给不同菌株、降解复杂生物材料、可持续农业和生物修复等。目前已有细菌间人工通讯和酵母向细菌方向通讯的报道，但革兰氏阳性细菌向真核酵母方向受控通讯尚未实现。因此该研究旨在建立从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）到酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的人工跨界通讯原理验证。

研究人员利用此前开发的枯草芽孢杆菌信号肽工具箱，将酿酒酵母α-信息素（α-pheromone）编码序列置于杆菌肽（bacitracin）诱导型启动子P_liaI控制下，整合至蛋白酶缺陷型B. subtilis WB800N的amyE位点，获得α-信息素生产者菌株TMB6428；同时，通过同源重组将mNeongreen荧光蛋白基因置于α-信息素诱导的FIG1启动子（P_FIG1）之下，整合入S. cerevisiae BY4741 ?bar1 ?far1基因组FAR1位点，构建传感器菌株。在LB添加2%葡萄糖的共培养基中，以酵母和细菌起始OD₆₀₀为0.1和0.6的比例共培养。经杆菌肽诱导后，B. subtilis通过Sec分泌途径输出α-信息素，被酵母细胞表面Ste2p受体（信息素受体）识别，激活信息素信号级联，驱动P_FIG1表达mNeongreen。Western blot、流式细胞术和落射荧光显微镜均证实酵母被成功激活，并在诱导后4 h起观察到典型的“shmoo”形态（酵母交配过程中的细胞形态变化），表明异源分泌的α-信息素具有完整生理活性。未诱导或与野生型B. subtilis共培养的对照均无显著信号。该研究首次证明了从B. subtilis到S. cerevisiae的受控人工跨界通讯，为设计传感器-执行器共培养回路提供了起点。

主要关键技术方法包括：利用同源重组和重叠延伸PCR（overlap-extension PCR）构建稳定基因组整合的工程菌株（生产者B. subtilis TMB6428和传感器S. cerevisiae BY4741 ?bar1 ?far1::FIG1_mNeongreen）；在LB+葡萄糖培养基中进行双菌共培养并优化起始细胞密度比例；用Western blot检测mNeongreen蛋白表达；用流式细胞术测定20,000个细胞平均荧光强度；用落射荧光显微镜观察荧光信号和shmoo细胞形态；用双尾Student's t检验进行统计学显著性评估。

研究结果如下。

信息素表达与单菌株检测：酶联免疫吸附测定（ELISA）证实B. subtilis TMB6428经杆菌肽诱导后可持续分泌α-信息素，浓度虽低于工业标准（最高约8 nM）但稳定；传感器酵母菌株经人工α-信息素诱导2 h即可产生mNeongreen荧光。

工程菌B. subtilis与S. cerevisiae的共培养：考虑到B. subtilis倍增时间约30 min、S. cerevisiae约90 min，且酵母基因组仅整合一个mNeongreen拷贝，研究人员采用LB+2%葡萄糖培养基并将起始OD₆₀₀比例设为1:6（酵母0.1，细菌0.6），该比例可成功维持共培养。

原理验证：信息素分泌型B. subtilis诱导α-信息素敏感的S. cerevisiae：Western blot显示诱导后2 h出现mNeongreen条带，4 h和22 h增强；流式细胞术显示诱导样品的平均荧光显著高于未诱导样品，且信号随时间增强；未诱导样品在4 h和22 h出现微弱信号，归因于P_liaI的固有泄漏表达。荧光显微镜在诱导后2 h观察到mNeongreen荧光，4 h起酵母出现shmoo形态，22 h更明显；野生型B. subtilis共培养无荧光。表明B. subtilis分泌的α-信息素能够激活酵母信息素通路。

讨论部分汇总：该研究将先前已建立的S. cerevisiae→B. subtilis通讯（通过芽孢杆菌群体感应肽CSF和PhrF，Volo?en等）拓展至B. subtilis→S. cerevisiae方向。mNeongreen作为一种比绿色荧光蛋白（GFP）更亮、更抗光漂白且成熟更快的荧光蛋白，适合作为报告基因；显微镜下观察到的shmoo形态进一步证明异源分泌α-信息素的生理功能。由于B. subtilis分泌的α-信息素浓度（约8 nM）低于阳性对照所用250 nM合成α-因子，mNeongreen信号强度较低，但仍足以诱导酵母反应。共培养可在常用LB+葡萄糖培养基中进行，方法简便经济。未来计划构建合成“传感器-执行器”共培养回路：由B. subtilis感应特定信号物质（如抗生素）并分泌酵母信息素，进而激活酵母表达降解酶；降解终产物可作为负反馈信号关闭回路。研究结论为：本研究成功证明了利用微生物天然通讯系统实现B. subtilis与S. cerevisiae之间的受控跨界信号传导。