《Brazilian Journal of Microbiology》：Temporal and production-related determinants of microbial counts in pingo, the natural starter culture of minas artisanal cheese
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米纳斯手工艺奶酪（Minas Artisanal Cheese，MAC）是巴西消费最广泛且最具代表性的手工艺奶酪之一，由生乳、凝乳酶、食盐以及当地称为pingo的天然发酵剂制成。Pingo是一种通过反向接种（backslopping）产生的内源
专业摘要翻译：
米纳斯手工艺奶酪（Minas Artisanal Cheese，MAC）是巴西消费最广泛且最具代表性的手工艺奶酪之一，由生乳、凝乳酶、食盐以及当地称为pingo的天然发酵剂制成。Pingo是一种通过反向接种（backslopping）产生的内源性发酵剂，它既向MAC奶酪中引入具有工艺价值的益生微生物，也引入腐败污染菌。近年来关于MAC微生物多样性的研究不断积累，但鲜有研究考察pingo中微生物的组成，或可能影响这一内源性培养物微生物载量的因素。本研究分析了来自分布于所有MAC生产微区域的50个奶酪生产单元的200份pingo样品，样品在四次半年一次的采样活动中采集。研究人员对乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）、总大肠菌群、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）以及酵母菌/霉菌进行了计数，并测定了pH和NaCl浓度。线性混合效应模型（linear mixed-effects models）显示，LAB计数在各采样活动中保持相似，尽管MRS琼脂上的计数与生产规模和pingo体积相关。湿季期间pingo中的总大肠菌群计数约高出十倍，而酵母菌/霉菌计数与季节和采样活动均相关。季节对金黄色葡萄球菌的影响取决于年份：2024年不同季节间计数无差异，但2025年旱季计数更高。规模较小的奶酪生产单元在pingo中表现出较低的金黄色葡萄球菌计数。挤奶基础设施、pH和NaCl浓度与所调查的任何微生物类群的计数均无关联。研究结果表明，湿季是潜在腐败微生物发生风险升高的时期，且这一风险与奶酪生产单元的规模以及已安装的产奶基础设施的稳健性无关。
论文解读
一、研究背景与目的
米纳斯手工艺奶酪（Minas Artisanal Cheese，MAC）是巴西消费最广泛且最具代表性的手工艺奶酪之一，2024年被联合国教科文组织列入人类非物质文化遗产代表作名录。MAC由生乳、凝乳酶、食盐和一种名为pingo的天然发酵剂制成。Pingo是一种通过反向接种（backslopping）产生的内源性发酵剂，其制作流程为：在奶酪第二次盐渍结束时收集排出的残余乳清，在环境温度下放置约15小时，于次日早晨接种到新一批生乳中。Pingo的化学成分复杂，含有蛋白质、脂质、碳水化合物、矿物盐和维生素，为反向接种期间的微生物生长提供营养。其NaCl浓度因盐添加量、盐颗粒度和乳清排出量而异。
Pingo的微生物组来源于三条途径的汇聚：生乳中的微生物（反映乳头卫生和畜群健康状况）、奶酪生产单元环境中的微生物（包括表面和空气源）、以及新鲜成型奶酪中的微生物（主要来自接种的pingo）。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是pingo中的优势菌群和主要酸化剂，Lactococcus、Streptococcus、Enterococcus、Lactobacillus和Leuconostoc在基于培养和测序的调查中反复出现。同时，pingo中也存在大量污染和腐败微生物，特别是大肠菌群和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
然而，以往研究局限于单个微区域或短期采样，缺乏覆盖全部十个MAC生产微区域、跨越多时间点的系统性调查。因此，研究人员分析了来自50个奶酪生产单元、分布于全部十个MAC生产微区域的200份pingo样品，在连续两年内进行四次采样活动（2024.1、2024.2、2025.1、2025.2），其中两次在旱季、两次在湿季，以同时评估季节性、年际间和生产相关因素的影响。该研究是首次在全部官方认可的MAC生产微区域、跨多次采样活动评估pingo微生物载量的纵向研究。
二、研究结果
LAB计数保持稳定：LAB在MRS和M17琼脂上的中位数分别为7.45和7.39 log?? CFU/mL，季节间无差异（p=0.463和p=0.457）。MRS琼脂上的LAB计数与生产规模和pingo体积相关，该关联仅在两个预测变量同时纳入模型时才显现。M17琼脂上的LAB计数与所评估的任何因素均无关联。研究人员将这种稳定性归因于每日反向接种的选择性压力：约15小时的乳清保留和再接种循环反复富集能够耐受渐进酸化和盐暴露的微生物。
总大肠菌群湿季升高：总大肠菌群计数在湿季比旱季约高十倍（+0.99 log?? CFU/mL），季节是该类群唯一显著相关的固定效应，且该效应在两年中均被重现。研究人员提出两种非排他性机制：降雨增加挤奶区域泥浆积累和乳头污垢负荷，增加挤奶期间转移的接种物；较高环境温度加速pingo在接种前存放期间的微生物生长。
金黄色葡萄球菌的季节效应依赖于年份：旱季和湿季计数在2024年相似（差异为?0.09 log?? CFU/mL，p=0.728），但在2025年急剧分化，相差2.62 log?? CFU/mL（p<0.001），几何平均计数相差约400倍。季节×年份交互项显著改善模型拟合（ΔAIC=48.4）。此外，金黄色葡萄球菌计数在中大型单元中比小型单元高（+0.61 log?? CFU/mL）。研究人员推测，规模的操作性成分是每批次贡献牛奶的动物数量，因为随着畜群规模增大，至少一头患有乳腺内感染的动物进入混合奶的概率上升。
酵母菌/霉菌的季节和年份双重效应：酵母菌/霉菌计数与季节（湿季+0.48 log?? CFU/mL）和年份（2025年+0.55 log?? CFU/mL）独立相关，两者间无交互作用。季节效应与湿季高相对湿度和20–30°C环境温度促进真菌在环境中持续存在、扩散以及在乳清基质中增殖一致。
pH、NaCl和挤奶基础设施无显著关联：pH范围3.51至7.00，NaCl浓度范围5.4至26.5 g/100 mL，变异范围广泛，但两者均与任何微生物类群无显著关联。pH与金黄色葡萄球菌之间的弱负相关（r=?0.17，p=0.014）在调整后未持续，表明存在混杂而非直接效应。挤奶区基础设施（混凝土地面、覆盖、挤奶坑）也未与任何微生物类群相关。
三、主要技术方法
研究人员从50个奶酪生产单元（分布于全部十个MAC生产微区域）采集200份pingo样品，每单元四次采样活动（2024.1、2024.2、2025.1、2025.2），覆盖旱季和湿季各两次。样品在4°C下保存至多36小时后处理。微生物计数方法包括：LAB在MRS琼脂（乳杆菌）和M17琼脂（乳球菌和链球菌）上按ISO 15214计数；酵母菌/霉菌用Compact Dry YM板；金黄色葡萄球菌用Compact Dry XSA板；总大肠菌群用Chromocult大肠菌群琼脂。pH用数字pH计测定，NaCl浓度用数字折光仪估算。统计分析采用对数转换后的线性混合效应模型（linear mixed-effects models），以嵌套在微区域内的奶酪生产单元作为随机效应，评估季节、年份、挤奶区卫生基础设施、生产规模、pH和NaCl对各类群的影响，并测试季节×年份交互项。辅助分析包括配对Wilcoxon符号秩检验、Mann–Whitney U检验、Kruskal–Wallis检验、Friedman检验和Spearman秩相关。
四、讨论与结论
讨论部分指出，该研究揭示两大核心发现：第一，pingo的发酵微生物群（LAB）在季节和年份间保持稳定，符合每日反向接种维持的培养物预期；第二，与卫生和安全相关的微生物类群，特别是总大肠菌群和金黄色葡萄球菌，受季节条件显著影响，表明环境因素主要影响不良微生物而非有益发酵群落。Pingo的微生物身份随时间保持，而微生物学风险随季节波动。
研究还强调了一个关键的方法论教训：若仅采样2024年，会得出季节对金黄色葡萄球菌无影响的结论；若仅采样2025年，会报告超过两个对数周期的差异。因此，天然发酵剂中污染物动态的调查需要跨多年、多次季节性采样和广泛的空间覆盖。
结论部分总结：时间因素、生产规模和挤奶基础设施对pingo微生物群的影响具有选择性而非统一性，决定因素取决于微生物类群。季节驱动污染物和腐败菌群，生产规模驱动金黄色葡萄球菌和部分发酵菌群，而挤奶基础设施、pH和NaCl不解释所观察到的任何变异。发酵菌群全程保持稳定，而金黄色葡萄球菌的季节效应取决于采样年份，单一年份的估计无法推广。湿季构成明确的风险升高窗口：总大肠菌群和酵母菌/霉菌均在此期间上升，且两者均促成同一腐败缺陷，因此湿季应加强挤奶前卫生和对pingo存放环境的控制。这些发现为pingo的风险导向管理提供了循证框架，支持制定适应米纳斯手工艺奶酪生产季节条件的监测策略。
