抗CD20治疗复发型多发性硬化中EBV特异性CD4+ T细胞选择性收缩、固有炎症重塑及MCP-3与sNfL关联的横断面研究

《Journal of Neurology》：Antiviral and inflammatory immune signatures in anti-CD20-treated multiple sclerosis: a cross-sectional study

　　

靶向CD20的单克隆抗体是复发型多发性硬化（relapsing multiple sclerosis, MS）的高效疗法。研究人员考察了抗CD20治疗如何重塑抗病毒T细胞免疫、固有炎症张力以及神经轴索损伤的血液标志物。在这项横断面研究中，复发型MS成人患者在罗马两个神经科中心入组。一个免疫表型分析队列（45例未治疗，25例抗CD20治疗，均接受ocrelizumab）通过高参数流式细胞术对40余个免疫细胞群体进行分析。另一个抗病毒队列（24例未治疗，13例治疗，19例健康供者）通过激活诱导标志物试验（activation-induced marker assay, AIM）评估对EBV、CMV和SARS-CoV-2的T细胞应答，通过多重检测评估细胞因子和趋化因子释放，并通过单分子阵列（single-molecule array, SiMoA）检测血清神经丝轻链（serum neurofilament light chain, sNfL）。组间比较采用Kruskal–Wallis检验并Dunn校正；相关性采用Spearman秩检验。抗CD20治疗耗竭总B细胞和转换记忆B细胞，同时保留抗体分泌细胞，并降低滤泡辅助T细胞（follicular helper T cells, TFh）和黏膜相关恒定T细胞（mucosal-associated invariant T cells, MAIT）的绝对计数。未治疗MS患者（patients with MS, pwMS）显示单核细胞白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和单核细胞趋化蛋白-3（monocyte chemotactic protein-3, MCP-3）升高，且pDC（plasmacytoid dendritic cells）干扰素-α（interferon-α, IFN-α）产生受损，而ocrelizumab治疗pwMS的pDC IFN-α应答与健康供者（healthy donors, HD）相当。EBV特异性CD4⁺ T细胞计数和刺激指数在ocrelizumab治疗pwMS中选择性降低，而CMV和SARS-CoV-2特异性应答在各组间相当。sNfL在未治疗pwMS中升高，并与基线和EBV刺激后的MCP-3相关。抗CD20治疗作用于B细胞之外的免疫环路，选择性收缩EBV导向的辅助T细胞免疫，同时保留其他抗病毒应答，并确定MCP-3为与pwMS神经轴索损伤相关的候选血液标志物。

多发性硬化（multiple sclerosis, MS）是中枢神经系统（central nervous system, CNS）最常见的慢性炎性脱髓鞘疾病，具有多因素、异质性和免疫介导特征，发生于遗传易感个体并受环境触发影响。病毒被认为是MS发病的重要环境因素，其中EBV（Epstein–Barr virus）是迄今最强的环境风险因素，EBV感染后MS发生风险约增加32倍，并伴随神经丝轻链（neurofilament light chain, NfL）水平升高。EBV感染的记忆B细胞可进入CNS，参与脑膜B细胞丰富三级淋巴结构形成、维持鞘内IgG产生并释放促炎细胞因子和趋化因子。B细胞通过抗原递呈、促炎细胞因子分泌及向自反应T细胞提供协同帮助，被视为MS发病的重要协调者，因此抗CD20单克隆抗体成为高效治疗策略。但该类治疗与感染风险增加、低丙种球蛋白血症及疫苗体液应答减弱相关；B细胞又参与抗病毒免疫调控，因此持续B细胞耗竭后其他免疫区室如何代偿、抗病毒防御是否全局受损，在pwMS中尚未解决。研究人员因此评估未治疗与ocrelizumab治疗pwMS中固有免疫、T细胞区室及其抗病毒应答的免疫扰动。

方法方面，该研究为观察性横断面研究，遵循STROBE指南，样本来自罗马San Camillo和Sant’ Andrea Hospitals，并由Santa Lucia Foundation伦理委员会批准。免疫表型队列包括45例未治疗pwMS和25例ocrelizumab治疗pwMS（中位治疗24个月）；抗病毒队列包括24例未治疗pwMS、13例ocrelizumab治疗pwMS（中位治疗18个月）和19例HD。关键技术包括：高参数流式细胞术分析全血中40余个免疫群体及绝对细胞计数；全血经R848刺激后以流式细胞术检测髓系细胞细胞因子/趋化因子产生；AIM试验以EBV、CMV和SARS-CoV-2肽池刺激外周血单核细胞18 h，检测CD4⁺ T细胞CD40L/CD69和CD8⁺ T细胞CD137/CD69；Luminex多重检测培养上清；SiMoA检测sNfL；采用Kruskal–Wallis、Dunn校正、Mann–Whitney和Spearman秩检验，且多重比较未校正。

研究结果中，第一个小标题为“综合免疫表型揭示抗CD20治疗对TFh和MAIT细胞的选择性影响”。研究人员通过高维流式细胞术发现，ocrelizumab治疗者总B细胞和转换记忆B细胞显著降低，抗体分泌细胞相对频率增加且绝对数稳定；在非B细胞区室中，TFh、CD4⁺CD161⁺ T细胞和MAIT细胞频率降低，绝对计数显示TFh和MAIT细胞显著减少。该结果说明抗CD20并非导致广泛T细胞丢失，而是选择性重塑关键辅助性和固有样T细胞区室。

第二个小标题为“抗CD20治疗揭示对病毒刺激的固有免疫应答”。研究人员用R848刺激全血并检测髓系亚群功能，发现固有免疫细胞亚群分布总体相当；未治疗pwMS中单核细胞IL-1β在基础和R848刺激后升高，MCP-3在经典、中间和非经典单核细胞中基础水平升高，治疗后中间和非经典单核细胞MCP-3应答降低；pDC基础IFN-α低，R848刺激后未治疗pwMS显著低于HD，而ocrelizumab治疗者pDC IFN-α应答与HD相当。该结果提示未治疗pwMS存在单核细胞促炎活性和pDC IFN-α低反应，抗CD20治疗后固有免疫部分正常化。

第三个小标题为“抗CD20治疗下EBV特异性CD4⁺ T细胞收缩”。研究人员用AIM试验检测病毒特异性T细胞，发现EBV VCA IgG血清阳性率在HD为95%、未治疗MS为96%、ocrelizumab治疗者为100%，CMV IgG血清阳性率分别为58%、67%和69%。EBV特异性AIM⁺ CD4⁺ T细胞绝对数在ocrelizumab治疗pwMS中显著低于HD和未治疗pwMS，EBV特异性CD4⁺ T细胞刺激指数也降低；CMV和SARS-CoV-2特异性CD4⁺ T细胞计数组间相当。CD8⁺ T细胞中，EBV、CMV和SARS-CoV-2特异性绝对数与刺激指数总体差异很小。表型分析显示，EBV刺激后ocrelizumab治疗者CD4⁺记忆亚群CM、EM1、EM2和EM3显著减少，CD8⁺仅EM1在EBV和CMV刺激后减少；EBV特异性CD4⁺ T细胞中CD25⁺、CD137⁺和ICOS⁺下调，CD4⁺与CD8⁺中CCR6⁺均降低。该结果说明ocrelizumab选择性削弱EBV特异性CD4⁺记忆激活，并降低其CCR6表达，而CMV和SARS-CoV-2应答大体保留。

在随后的可溶性介质与sNfL分析中，研究人员用Luminex检测培养上清，发现病毒肽刺激后各组间无显著差异，但未刺激基础条件下未治疗pwMS的IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-23、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、GM-CSF和G-CSF显著升高；抗CD20治疗后IL-2和IL-23降低并趋近HD，其他介质仍可升高。SiMoA检测显示未治疗pwMS的sNfL显著高于HD，ocrelizumab治疗者总体数值较低，但有个别患者治疗超过1年后sNfL持续升高。按中位sNfL 12.6 pg/mL分层，高sNfL者MCP-3、MIP-1α和MIP-1β较高，其中MIP-1α和MIP-1β仅在EBV刺激后达名义显著，MCP-3在基础和EBV刺激后均呈差异；刺激诱导变化在sNfL分层间不显著。MCP-3在未治疗pwMS中与sNfL正相关，基础条件下Spearman r=0.67，P=0.03，EBV刺激后r=0.72，P=0.01，CMV和SARS-CoV-2条件无显著相关；ocrelizumab治疗后该相关性消失，但正式交互检验未显示治疗组间差异。

讨论部分认为，抗CD20治疗除耗竭B细胞外，还显著影响TFh和MAIT细胞。TFh降低与B细胞耗竭破坏B-T细胞相互作用、影响生发中心反应相一致；MAIT降低的机制尚未完全清楚，原文提到可能涉及B细胞来源信号减少、IL-23降低以及部分T细胞表达CD20而被直接清除，但未确定。cDC2增加可能反映B细胞作为抗原递呈细胞缺失后的稳态补偿。未治疗pwMS中单核细胞IL-1β和MCP-3升高、pDC IFN-α低反应，提示持续促炎与负反馈不足；治疗后部分降低。EBV特异性CD4⁺ T细胞减少支持去除EBV感染记忆B细胞后抗原刺激降低的假说。Bjornevik等报告抗CD20治疗使EBV特异性CD4⁺ T细胞应答降低2.5至3.3倍，对CMV、VZV和细菌抗原影响较小，并消除唾液EBV脱落及循环B细胞EBV载量。CCR6降低提示EBV特异性T细胞神经侵袭潜力减弱。CMV和SARS-CoV-2应答保留及pDC IFN-α正常说明细胞抗病毒防御未全局侵蚀，感染风险更多由低丙种球蛋白血症而非T细胞免疫丧失驱动。MCP-3与sNfL关联使其成为神经轴索损伤候选标志物。局限包括横断面设计不能因果推断、样本量较小、仅外周血、以意大利复发型MS为主、缺少HLA分型、SARS-CoV-2疫苗史不完整、临床元数据不全且仅使用ocrelizumab。

研究结论翻译：总之，抗CD20治疗与B细胞区室之外的广泛免疫改变相关，包括TFh和MAIT细胞选择性收缩、pDC IFN-α产生保留，以及EBV特异性CD4⁺ T细胞应答降低，而CMV和SARS-CoV-2特异性细胞应答在各组间基本相当。ocrelizumab治疗pwMS的EBV特异性T细胞还显示CCR6⁺细胞比例降低，进一步提示其神经侵袭潜力减弱。最后，MCP-3在未治疗pwMS中与sNfL相关，将该趋化因子定位为神经轴索损伤的候选生物标志物；然而，刺激诱导的趋化因子应答在sNfL分层间无差异，且该关联未正式显示在治疗后不同，因此EBV特异性机制仍有待确立。