H9N2禽流感病毒在番鸭中的全国性流行病学调查与疫苗效力评估

《Veterinary Research》：H9N2 avian influenza virus in Muscovy ducks: a nationwide epidemiological survey and vaccine efficacy assessment

　　

摘要专业翻译 禽流感病毒（avian influenza viruses, AIVs）被公认为对家禽健康和全球粮食安全构成持续威胁。H9N2亚型在家禽中广泛分布。2022年至2024年，研究人员在中国华南、华北、华中和西南地区开展了一项全国性流行病学调查，涵盖番鸭养殖场和活禽市场。共采集1208份番鸭血清样本、1212份番鸭来源的口咽/泄殖腔拭子及肺/气管组织样本，以及480份鸡来源样本。此外，共分离获得31株H9N2病毒，其中2株来源于番鸭，29株来源于鸡。研究人员建立了一种新型共感染攻毒模型，将H9N2眼鼻接种与大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）注射相结合，该模型可诱导与自然田间病理表现高度相似的重度气管病变。该共感染攻毒模型成功复现了田间常见的病毒-细菌协同作用场景，导致严重肺部病变和病毒载量显著升高。结果表明，灭活疫苗和活载体疫苗提供了超过80%的保护效力，并显著减少病毒排毒和临床症状。本研究强调了更新疫苗以匹配流行毒株的迫切性，以及建立在实际共感染场景下评估家禽疫苗的验证框架的必要性。

论文解读

一、研究背景与科学问题

禽流感病毒（avian influenza viruses, AIVs）属于A型流感病毒家族，宿主范围广泛，包括家禽、野鸟和人类，广泛分布于欧亚大陆和北美。水禽是AIVs的自然储存宿主。AIVs通过多种途径传播，包括候鸟迁徙、呼吸道飞沫和粪便。根据血凝素（hemagglutinin, HA）和神经氨酸酶（neuraminidase, NA）两种蛋白的抗原多样性，AIVs被分为18个HA亚型和11个NA亚型。其中，H5N6和H7N9等H5或H7亚型已被证实具有高致病性，而包括H9N2在内的其余亚型被认为低致病性。

尽管H9N2的相对致病性较低，但自1992年在中国首次分离以来，它已成为全球家禽中流行最广泛、危害最严重的亚型，超过了H5N6和H7N9。其持续流行归因于三个主要因素：第一，候鸟迁徙显著促进其传播；第二，家禽与野鸟的接触是病毒传播的关键因素；第三，抗原漂移导致免疫逃逸，使基于常规疫苗的控制措施失效。

H9N2低致病性禽流感病毒（low-pathogenicity avian influenza virus, LPAIV）对家禽业和公共卫生均构成重大威胁，这归因于其广泛的宿主适应性、抗原漂移以及作为高致病性病毒（如H5N1和H7N9）“基因供体”的角色。疫苗接种被广泛认为是疾病预防的关键策略，但持续的病毒变异导致传统疫苗效力下降。目前灭活疫苗因其安全且成本效益高而主导市场，但易受病毒抗原漂移影响。活减毒疫苗通过模拟自然感染的复制诱导广泛的黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫，从而赋予交叉保护，但需关注毒力返强的可能性。载体疫苗利用鸭肠炎病毒（duck enteritis virus, DEV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）等载体表达关键H9N2抗原，具有发展为多价疫苗的潜力。核酸疫苗通过直接使用DNA或mRNA靶向关键抗原，也易于改造为多价疫苗。

针对上述研究空白，本研究设计为一项逐步推进、假设驱动的研究，将流行病学监测、机制性发病机制建模和疫苗评估联系起来。全国性监测显示番鸭（Cairina moschata）广泛暴露于H9N2病毒，但病毒分离率较低，提示田间条件下感染常以亚临床或短暂形式发生。然而，商业养殖场中经常观察到严重呼吸道疾病，提示其他辅助因素可能促进疾病进展。基于这些流行病学观察，研究人员假设继发性细菌感染可能在加剧疾病严重程度中发挥关键作用。

二、研究内容与主要结论

研究人员于2022年至2024年在中国华南、华北、华中和西南地区的番鸭养殖场和活禽市场开展全国性流行病学调查，共采集1208份番鸭血清样本、1212份番鸭来源拭子和组织样本及480份鸡来源样本。血清学调查显示H9抗体总阳性率为69.7%（95% CI 67.0–72.3%），广东DP养殖场和安徽GS养殖场阳性率最高，部分鸡群几何平均滴度（geometric mean titer, GMT）达9.11 log₂，表明H9N2在番鸭群体中广泛流行。病毒分离方面，从1212份番鸭样本中分离出2株H9N2病毒（分离率0.2%），从480份鸡样本中分离出29株（分离率6.0%），分布于广东、福建、河北、云南等省份。

HA基因系统发育分析显示31株分离株聚为四个主要谱系：H9.3、H9.4.2.5a、H9.4.2.5b和H9.4.2.5c。大多数菌株（19/31）属于H9.4.2.5a分支，9株属于H9.4.2.5b，3株属于H9.4.2.5c。仅一株番鸭来源分离株（DK/FJ/PT/2024）属于H9.3分支，表明当前流行中存在多个进化分支共存。所有分离株均具有低致病性裂解位点基序（PAGSSR↓GLF、PSRSSR↓GLF或PAASDR↓GLF），缺乏连续多个碱性氨基酸，确认其LPAIV分类。受体结合位点（receptor-binding site, RBS）序列分析显示178–185位存在四种主要氨基酸模式，变异主要发生在178和180位。潜在N-糖基化位点分析显示两种与系统发育聚类相关的主要糖基化模式，H9.4.2.5a和5b分支菌株通常在HA1的29、82、141、298、305和313位具有糖基化位点，而H9.4.2.5c分支菌株呈现替代性糖基化谱。

研究人员建立了H9N2-大肠杆菌（E. coli）序贯共感染攻毒模型。攻毒实验中，共感染番鸭在整个观察期间未见明显临床症状。口咽和泄殖腔拭子检测显示，1和3天感染后（days post-infection, dpi）100%的鸭检测到病毒RNA，5 dpi阳性率降至80%，10 dpi仅20%阳性。组织病毒载量分析显示，共感染组在肝脏和胸腺中检测到病毒RNA，而H9N2单感染组未检测到，表明继发性大肠杆菌感染可能促进病毒在体内更广泛的播散。组织病理学分析证实该组出现气管黏膜损伤和肺间质出血，与自然感染高度相似。

疫苗效力评估中，免疫后平均HI抗体滴度为灭活疫苗8.4 log₂、商品化疫苗10.8 log₂、DEV-H9N2载体疫苗7.2 log₂。攻毒后，免疫组番鸭在整个观察期间无明显临床异常。病毒排毒方面，攻毒对照组在所有时间点均检测到排毒，而免疫组在1、3和5天攻毒后（challenge post-inoculation, cpi）检测到排毒但病毒滴度显著低于对照组，10 cpi时所有免疫组均检测为阴性。3 cpi时病毒排毒抑制率为灭活疫苗90%、商品化疫苗90%、DEV-H9N2载体疫苗80%，5 cpi时所有组均达90%抑制，10 cpi时无排毒。病理观察显示免疫组病变轻微，而攻毒对照组出现严重肺充血和气管炎症。三种疫苗均对番鸭来源H9N2毒株提供超过80%的保护。

三、主要关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：全国多区域流行病学采样调查，涵盖华南、华北、华中和西南地区的番鸭养殖场和活禽市场，采集血清、拭子和组织样本；病毒分离与鉴定，通过SPF鸡胚接种、血凝（hemagglutination, HA）和血凝抑制（hemagglutination inhibition, HI）试验及RT-PCR分子鉴定；系统发育分析，采用最大似然法构建HA基因进化树，并分析裂解位点、糖基化位点和受体结合位点等关键氨基酸位点；H9N2-大肠杆菌序贯共感染攻毒模型建立，通过眼鼻接种H9N2后5天肌肉注射大肠杆菌模拟田间感染场景；疫苗制备与效力评估，包括灭活疫苗制备和活载体疫苗免疫后攻毒保护评价。

四、研究结果详述

流行病学调查结果：1208份番鸭血清样本的血清学调查显示H9抗体总阳性率为69.7%（95% CI 67.0–72.3%），广东DP养殖场和安徽GS养殖场阳性率最高。从1212份番鸭样本中分离出2株H9N2病毒（分离率0.2%），从480份鸡样本中分离出29株（分离率6.0%），分布于多个省份。

H9N2分离株遗传特征：系统发育分析显示31株分离株聚为H9.3、H9.4.2.5a、H9.4.2.5b和H9.4.2.5c四个主要谱系，大多数菌株属于H9.4.2.5a分支。所有分离株均具有低致病性裂解位点基序。受体结合位点存在四种主要氨基酸模式，糖基化位点呈现两种与系统发育聚类相关的主要模式。

H9N2-大肠杆菌共感染攻毒模型建立：攻毒实验中，共感染番鸭未见明显临床症状。病毒排毒动力学显示1和3 dpi时100%阳性，随后逐渐下降。组织病毒载量分析显示共感染组在肝脏和胸腺中检测到病毒RNA，而单感染组未检测到。组织病理学分析证实共感染组出现气管黏膜损伤和肺间质出血，与自然感染高度相似。

疫苗效力评估：免疫后各组均产生较高HI抗体滴度。攻毒后，免疫组番鸭无明显临床异常，病毒排毒显著减少，10 cpi时所有免疫组均检测为阴性。3 cpi时病毒排毒抑制率为80%–90%，5 cpi时均达90%。组织病毒载量分析显示免疫组病毒复制减少。病理观察显示免疫组病变轻微。三种疫苗均提供超过80%的保护效力。

五、讨论与结论

讨论部分指出，全国性监测显示番鸭H9N2抗体血清阳性率高但病毒分离率相对较低，这种差异表明H9N2在该宿主中的感染可能常以亚临床或短暂形式发生。番鸭在水生和陆生家禽系统界面占据重要生态位，在该物种中检测到遗传多样的H9N2病毒表明其在病毒维持和传播中的潜在作用。分子特征分析揭示受体结合区序列模式和与分支相关的N-糖基化位点构型，糖基化修饰可能降低抗体对中和表位的可及性，促进免疫逃逸，影响疫苗长期效力。共感染模型的建立更好地模拟了田间常见的病毒-细菌协同作用场景，为疫苗评估提供了更严格且生物学相关的框架。疫苗免疫不仅保护免受临床疾病，还限制病毒播散，对控制番鸭群体中H9N2病毒具有重要意义。

研究结论可概括为：全国性流行病学调查证实H9N2病毒在番鸭群体中广泛流行，病毒分离株呈现多谱系共存和分子多样性特征；建立的H9N2-大肠杆菌共感染模型成功复现田间病毒-细菌协同作用场景；灭活疫苗和活载体疫苗在共感染条件下均提供超过80%的保护效力，显著减少病毒排毒和临床症状。本研究强调持续进行分子和抗原监测对于监测病毒进化和优化疫苗策略以确保有效疾病控制的必要性。