SynNotch CD123和CLL1双抗原AND门控CAR-T细胞靶向急性髓系白血病并降低CLL1 CAR-T相关脱肿瘤毒性

《Molecular Biomedicine》：Synthetic Notch CD123 and CLL1 chimeric antigen receptor T-cells (CAR-T) target acute myeloid leukemia and reduce off-tumor effects associated with CLL1 CAR-T cells

　　

靶向C型凝集素样分子-1（CLL1）抗原的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法已成为急性髓系白血病（AML）的一种有前景的治疗策略。然而，其临床转化受到靶向、脱肿瘤毒性的阻碍，尤其是CLL1在正常中性粒细胞上表达所致的严重中性粒细胞减少。为解决这一限制，研究人员构建了靶向CD123和CLL1的合成Notch（SynNotch）双抗原AND门控CAR-T系统，以提高肿瘤特异性并降低脱肿瘤毒性。研究人员首先通过流式细胞术评估AML细胞系和原代AML原始细胞中CD123和CLL1的表达。随后评估工程化CAR-T细胞的体外细胞毒性、连续杀伤活性、细胞因子分泌、耗竭相关蛋白标志物和转录组谱，并在AML异种移植模型中进一步考察治疗疗效和安全性。SynNotch CD123和CLL1 CAR-T细胞对AML原始细胞表现出更强细胞毒性，同时对正常中性粒细胞的活性降低。此外，这些细胞表现出耗竭相关基因和标志物表达降低，以及与幼稚/记忆分化相关基因表达升高。在体内，该CAR-T变体表现出改善的扩增、更长的持久性和更强的抗白血病活性，同时中性粒细胞减少较轻。体外细胞因子产生增加表明T细胞激活更强，但也提示需要仔细评估潜在的细胞因子相关毒性。这些发现表明，SynNotch双抗原门控CAR-T细胞可能为复发/难治性AML提供更特异且可能更安全的治疗策略。

该论文发表于《Molecular Biomedicine》。急性髓系白血病（AML）是一种侵袭性血液肿瘤，复发频繁且死亡率高。现有标准治疗包括传统化疗、分子靶向治疗和造血干细胞移植（HSCT），但HSCT受移植相关并发症和供者相容性限制。CAR-T疗法在B细胞恶性肿瘤中取得显著进展，但在AML中仍面临挑战。CD33、CLL1、CD70等AML相关抗原在正常造血细胞上也有表达，单靶CAR-T易产生靶向、脱肿瘤毒性，损伤健康组织。CLL1 CAR-T虽在临床研究中显示抗白血病活性，但其临床应用受严重且持续的中性粒细胞减少限制，并增加感染风险。研究人员在59例接受CLL1 CAR-T治疗的AML患者中观察到，几乎所有患者出现3/4级粒细胞减少，感染常见。CD123在原代AML细胞包括白血病干细胞（LSC）中高表达，并与CLL1在约80%的AML患者中共表达，且不在成熟中性粒细胞表达，因此适合作为启动抗原。基于此，研究人员设计CD123启动的SynNotch AND门控电路，仅在CD123和CLL1双阳性白血病细胞中条件性触发CLL1 CAR表达，以降低单抗原CLL1 CAR-T相关骨髓毒性。研究通过体外功能实验、转录组分析和体内异种移植验证，评估双靶CAR-T构建体的直接和连续杀伤、对正常中性粒细胞的毒性、耗竭与幼稚/记忆分化特征，以及体内扩增、持久性和安全性。该分层抗原识别策略不同于简单双顺反子共表达双CAR系统，其通过层级SynNotch激活实现时空控制的CAR表达，为复发/难治性AML提供可编程免疫治疗框架。

技术方法概述：研究人员回顾性分析59例接受CLL1 CAR-T治疗的AML患者临床资料，样本来自天津第一中心医院，试验注册号ChiCTR2000041054；收集患者原代AML细胞、健康供者外周血单个核细胞（PBMC）及AML细胞系。采用流式细胞术检测CD123/CLL1表达、转导效率和CAR-T表型；构建慢病毒载体表达CD123 SynNotch受体和Gal4-UAS驱动CLL1 CAR；进行体外杀伤、连续杀伤、细胞因子检测；RNA测序分析差异基因；建立NSG小鼠AML异种移植模型，用生物发光成像、生存及外周血流式监测疗效和持久性；GraphPad Prism 9.0统计分析。

研究结果如下。CLL1 CAR-T治疗中观察到的患者反应和并发症：通过回顾59例临床数据，输注后14–16天评估，完全缓解（CR）率为69.49%，其中16例为微小残留病（MRD）阳性CR，25例为MRD阴性CR，30.51%无反应；细胞因子释放综合征（CRS）发生率为94.92%，免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）为16.95%，3/4级CRS为35.59%，3/4级ICANS为8.47%；多数患者出现白细胞减少、粒细胞减少、贫血和血小板减少，细菌、病毒和真菌感染分别有43、12和17例；严重CRS患者C反应蛋白、白介素-6（IL-6）和白介素-10水平更高。结论是CLL1 CAR-T具有抗白血病活性，但骨髓抑制和感染风险突出。

筛选SynNotch“AND”逻辑门控靶点以降低CLL1 CAR-T细胞的脱肿瘤效应：通过流式检测AML细胞系和90例原代AML原始细胞，CD123阳性率为91%，中位表达61%；CLL1阳性率为86%，中位表达63%；80%的AML病例共表达CD123和CLL1。CD123抗原暴露后6小时内可检测CLL1 CAR诱导，并持续至少48小时。慢病毒转导效率分别为76.31%和86.83%。在三轮连续杀伤实验中，SynNotch CD123和CLL1 CAR-T细胞对MOLM13和HL60的细胞毒性均高于CLL1 CAR-T细胞，第三轮中干扰素-γ（IFN-γ）、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平显著更高。结论是SynNotch设计可增强持续抗AML活性并可能降低CLL1单靶脱肿瘤效应。

SynNotch CD123和CLL1 CAR-T细胞可有效裂解原代AML细胞：通过3例复发/难治性AML患者原代细胞，在效应细胞与靶细胞比（E:T）1:3下共培养8、24和48小时，SynNotch CAR-T细胞杀伤效率显著高于CLL1 CAR-T细胞，48小时上清中IL-6和IFN-γ水平更高；对健康供者CD33⁺中性粒细胞共培养24小时后，SynNotch CAR-T细胞毒性显著降低。结论是该双靶CAR-T保留抗AML活性，同时减少对中性粒细胞的损伤。

SynNotch CD123和CLL1 CAR-T细胞表现出持续激活：通过RNA测序比较两组CAR-T细胞，SynNotch组下调耗竭相关基因LTA、BATF3、GZMB、LAG3和JUNB，上调幼稚/记忆分化相关基因IL7R、LEF1、CD44和KLF3；基因本体分析显示上调基因主要与免疫反应和细胞因子介导信号相关，下调基因富集于代谢和氧化还原过程；京都基因与基因组百科全书分析显示MAPK和JAK-STAT信号通路在上调基因中富集；蛋白水平上PD-1和CTLA4表达低于CLL1 CAR-T组。结论是转录组和蛋白水平均支持SynNotch CAR-T细胞耗竭较低、幼稚/记忆分化增强。

SynNotch CD123和CLL1 CAR-T细胞在AML异种移植模型中有效清除白血病细胞：通过NSG小鼠AML异种移植模型，生物发光成像显示CLL1 CAR-T和SynNotch CAR-T均显著抑制肿瘤生长并改善生存；SynNotch组第14天IFN-γ释放高于CLL1 CAR-T组，TNF-α和IL-6无显著增加；利用Myc tag和RQR8流式监测，SynNotch CAR-T细胞显示更好的扩增和持久性。结论是该双靶CAR-T可在体内识别并清除AML细胞，具有更强持久性和疗效。

讨论部分总结：AML异质性导致治疗反应差异，CD123、CD33和CLL1等CAR-T有前景，但疗效有限和毒性仍是障碍。SynNotch CAR-T可背景依赖激活、通过合成信号通路释放细胞因子、支持多抗原识别并具有可编程性，AND门控机制可能限制不受控细胞因子释放并降低CRS严重程度。本研究中，SynNotch组体内IFN-γ升高，TNF-α和IL-6未显著升高；但体外IL-6增加提示过度细胞因子分泌仍可能带来CRS风险，需控制T细胞激活并多时间点监测，且应将CRS相关细胞因子与神经毒性、呼吸衰竭等毒性终点分开评估。该研究首次将SynNotch技术用于AML双靶CD123和CLL1 CAR-T设计，提供体外、转录组和动物模型证据。相比传统单靶CLL1 CAR-T，该AND门控系统仅在识别CD123和CLL1后激活CLL1 CAR表达，从而更特异杀伤AML细胞，减少对CLL1单阳性正常中性粒细胞的损伤，有望减轻严重中性粒细胞减少。转录组显示耗竭相关基因下调和幼稚/记忆相关基因上调，提示更长久存续和抗肿瘤能力。未来需采用CD34⁺造血干细胞人源化NS小鼠、多中心样本、机制实验、长期示踪和重复肿瘤再挑战，优化载体和SynNotch调控电路，引入自杀基因和细胞因子调控模块，优化Gal4-UAS诱导效率和抗CD123单链抗体亲和力，探索非病毒递送，并与免疫检查点抑制剂、代谢调节剂和表观遗传修饰剂联合，扩展至其他髓系肿瘤，推进I期试验、GMP级制备和质量释放指标。研究结论翻译：这些发现表明，SynNotch双抗原门控CAR-T细胞可能为复发/难治性AML提供更特异且可能更安全的治疗策略。