芦丁通过干扰hnRNP L相分离调控PKM2–乳酸–H3K9la轴改善肺纤维化的机制研究

《Frontiers in Pharmacology》：Rutin interferes with hnRNP L phase separation and modulates the PKM2–lactate–H3K9la axis in pulmonary fibrosis

　　

背景：肺纤维化是一种慢性进行性肺部疾病，治疗选择有限，亟需开发新药。

目的：本研究探讨了芦丁（rutin）的抗肺纤维化作用及其机制，并寻求为进一步开发抗肺纤维化候选化合物提供先导结构。

方法：研究人员在转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1）刺激的医学研究委员会细胞株-5（Medical Research Council cell strain-5，MRC-5）细胞中，利用细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）、实时细胞增殖分析和划痕愈合实验评估芦丁的抗肺纤维化作用；同时在诱导肺纤维化小鼠中进行肺功能检测、显微计算机断层扫描（MicroCT）、苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin，H&E）和Masson染色。研究人员通过分子对接、表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）实验、细胞热位移分析（cellular thermal shift assay，CETSA）、液滴形成观察、光漂白后荧光恢复（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）、转录组测序、酶联免疫吸附实验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）和染色质免疫沉淀-聚合酶链反应（Chromatin Immunoprecipitation-Polymerase Chain Reaction，ChIP-PCR）探索芦丁的作用机制。

结果：芦丁抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化、肌成纤维细胞增殖和迁移以及细胞外基质沉积。此外，芦丁有效改善肺功能，包括用力肺活量、动态肺顺应性和总肺容量。另外，芦丁显著减轻纤维化特征，如蜂窝肺减少、肺泡结构保留和肺泡壁变薄。机制上，研究数据支持这样一个模型：芦丁可能干扰异质性胞核核糖核蛋白L（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L，hnRNP L）的相分离，这种干扰与M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2，PKM2）生成减少、乳酸产生降低以及随后H3K9乳酰化（H3K9la）丢失相关。而H3K9la的减少又与PKM2转录受抑制相关，提示存在一个自我限制的调节回路。

结论：研究结果表明，芦丁可能干扰涉及hnRNP L相分离、PKM2可变剪接、乳酸和H3K9la的调控互作网络，这与肺纤维化的减轻相关。尽管这些数据揭示了一个潜在的机制框架，但该调控轴每一步的确切因果关系仍有待确立。需要进一步研究来验证这一模型，并优化芦丁治疗应用的生物利用度。

论文解读：芦丁通过干扰hnRNP L相分离调控PKM2–乳酸–H3K9la轴改善肺纤维化的机制研究

肺纤维化是一种慢性进行性间质性肺疾病，确诊后中位生存期仅3–5年，发病率逐年上升。其典型组织病理学特征是成纤维细胞异常激活并分化为肌成纤维细胞，后者过度沉积细胞外基质，导致肺结构不可逆重塑和呼吸功能进行性丧失。目前临床仅批准尼达尼布（nintedanib）和吡非尼酮（pirfenidone）两种抗纤维化药物，二者虽能延缓用力肺活量下降，但无法阻止或逆转疾病进展，且伴有明显胃肠道不良反应。因此，发现新的生物活性化合物并阐明其作用机制，是抗肺纤维化新药研发的迫切需求。

天然产物是抗纤维化药物的重要来源。芦丁（rutin）是一种广泛存在于多种植物中的黄酮醇糖苷，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种药理活性。已有研究报道芦丁可减轻博来霉素（bleomycin，BLM）诱导的小鼠肺纤维化，并抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞肌成纤维细胞分化，提示其具有抗肺纤维化活性。然而，芦丁的直接分子靶点以及超越其经典抗氧化和抗炎作用之外的精确抗纤维化机制仍不清楚。

异质性胞核核糖核蛋白L（hnRNP L）是一种RNA结合蛋白，作为剪接因子调控细胞存活、增殖和分化相关基因的可变剪接，并通过环状RNA反向剪接促进肺纤维化。序列分析显示hnRNP L含有内在无序区（intrinsically disordered regions，IDRs），这是具有相分离倾向蛋白的结构标志。许多RNA结合蛋白通过液-液相分离（liquid–liquid phase separation，LLPS）形成动态生物分子凝聚体来执行功能。异常LLPS与多种疾病相关，但hnRNP L在肺纤维化中是否发生相分离以及能否被药理学靶向，此前尚无报道。M2型丙酮酸激酶（PKM2）是糖酵解限速酶，可促进肌成纤维细胞分化和肺纤维化进展；PKM2依赖性糖酵解增强可升高乳酸水平，为组蛋白乳酰化提供底物，其中H3K9la参与纤维化重塑，但其在肺成纤维细胞中的上游调控尚不完全明确。基于上述背景，研究人员提出假设：芦丁直接结合hnRNP L并抑制其相分离，从而破坏涉及PKM2可变剪接、乳酸生成和H3K9la修饰的代谢–表观遗传反馈回路，最终减轻肺纤维化。

为验证这一假设，研究人员首先在体外采用TGF-β1刺激的MRC-5和IMR-90人胚肺成纤维细胞，通过CCK-8、实时细胞分析（RTCA）、划痕愈合实验等评估芦丁对成纤维细胞增殖、迁移和分化的影响；在体内采用BLM诱导的C57BL/6小鼠肺纤维化模型，通过肺功能检测、MicroCT成像、H&E和Masson染色评估芦丁对肺纤维化的干预效果。机制研究层面，研究人员运用分子对接预测芦丁与hnRNP L的结合模式，利用表面等离子共振（SPR）和细胞热位移分析（CETSA）验证二者的直接结合；通过液滴形成实验和荧光漂白后恢复（FRAP）观察hnRNP L的相分离行为；采用纳米孔转录组测序和差异剪接分析（SUPPA2）鉴定hnRNP L下游靶基因；结合ELISA检测胞内乳酸水平、免疫共沉淀（Co-IP）验证P300与H3K9la的相互作用、染色质免疫沉淀-聚合酶链反应（ChIP-PCR）检测H3K9la在PKM启动子区的富集变化。此外，研究人员构建了EGFP-hnRNP L全长及IDR截短突变体（Δ1-111和274-384）质粒和腺相关病毒载体（AAV2/5），分别用于体外和体内过表达实验，以验证hnRNP L相分离能力与其促纤维化功能的因果关系。

研究结果显示：第一，芦丁在体外具有抗肺纤维化效应。CCK-8实验显示芦丁对TGF-β1激活细胞的半数抑制浓度（IC50）显著低于正常细胞，提示其选择性抑制病理表型细胞生长。实时细胞分析和划痕愈合实验表明芦丁抑制活化成纤维细胞的增殖和迁移；免疫荧光和Western blot证实芦丁下调α-SMA、波形蛋白、胶原I和成纤维细胞活化蛋白1（FAP1）的表达，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化及细胞外基质沉积。

第二，芦丁在体内减轻肺纤维化。BLM诱导的小鼠肺功能检测显示芦丁改善用力肺活量、动态肺顺应性和总肺容量；MicroCT显示芦丁减轻蜂窝肺和斑片状阴影；H&E和Masson染色显示芦丁减少胶原沉积、保持肺泡结构完整；Western blot证实芦丁下调肺组织中FAP1、波形蛋白、α-SMA和胶原I的表达。

第三，芦丁直接结合hnRNP L并抑制其表达。分子对接预测芦丁与hnRNP L多个氨基酸残基存在相互作用；SPR测得结合平衡解离常数（KD）约为19.48 μM；CETSA显示芦丁处理提高hnRNP L蛋白在高温下的热稳定性，证实胞内直接结合。芦丁在mRNA和蛋白水平均抑制hnRNP L表达，而hnRNP L过表达可逆转芦丁对α-SMA、FAP1、波形蛋白和胶原I的下调作用。

第四，芦丁干扰hnRNP L相分离。hnRNP L含两个IDR区段（1–101和336–383氨基酸），纯化的EGFP-hnRNP L蛋白在含PEG6000的溶液中可形成液滴，FRAP显示光漂白后荧光可恢复，说明其具有相分离能力。在MRC-5细胞中，TGF-β1促进EGFP-hnRNP L核内斑点形成，芦丁抑制此效应；而IDR截短突变体（Δ1-111和274-384）无法形成相分离。功能上，过表达全长hnRNP L促进促纤维化蛋白表达，但过表达IDR截短突变体无此效应，说明相分离能力是hnRNP L促纤维化功能所必需的。

第五，芦丁对hnRNP L相分离的干扰与其体内抗纤维化作用相关。经气管喷雾给予AAV2/5介导的hnRNP L过表达，可逆转芦丁对BLM小鼠肺功能（FVC、Cdyn、TLC）的改善作用，加重MicroCT和组织学可见的纤维化病变，并抵消芦丁对FAP1、波形蛋白、α-SMA和胶原I的下调作用；而hnRNP L-Δ1-111和274-384过表达则不影响芦丁的治疗效果，从体内层面证实芦丁的抗纤维化效应依赖于对hnRNP L相分离的干扰。

第六，芦丁以hnRNP L相分离依赖的方式调节PKM2可变剪接。纳米孔转录组测序及GO/KEGG富集分析显示，hnRNP L敲低显著影响糖酵解通路相关基因表达，PKM为其中变化最显著的基因之一。SUPPA2剪接分析识别出多个糖酵解酶（如PKM、PFKM、ALDOA、ENO1）存在hnRNP L依赖的剪接变化。qRT-PCR显示芦丁下调PKM2 mRNA、上调PKM1 mRNA，hnRNP L过表达逆转此效应。RNA免疫沉淀（RIP）证实hnRNP L结合PKM前体mRNA，芦丁减少该结合。Western blot确认芦丁降低PKM2蛋白水平，而hnRNP L敲低同样下调PKM2；hnRNP L过表达可逆芦丁对PKM2的抑制，但IDR截短突变体无此逆转能力。

第七，芦丁调节PKM2–乳酸–H3K9la调控轴。ELISA检测显示芦丁和hnRNP L siRNA降低胞内乳酸水平，hnRNP L过表达升高乳酸水平并逆转芦丁的抑制作用。在多种乳酰化组蛋白中，芦丁显著降低H3K9la；PKM2抑制剂（PKM2-IN-1）同样降低H3K9la，PKM2过表达则逆转此效应。Co-IP实验表明P300与H3K9la存在相互作用，芦丁抑制TGF-β1诱导的H3K9la增加。ChIP-PCR显示TGF-β1增强H3K9la在PKM启动子区的富集，芦丁减少该富集，hnRNP L过表达逆转芦丁的作用而IDR截短突变体无此作用。代谢物挽救实验证实，外源性乳酸可逆转芦丁对PKM总mRNA和PKM2转录本的抑制作用，支持乳酸维持PKM转录的功能。最后，PKM2抑制剂降低α-SMA等纤维化蛋白表达，PKM2过表达则抵消此效应。

讨论部分指出，芦丁通过干扰hnRNP L相分离进而调节PKM2–乳酸–H3K9la轴的机制，为天然产物通过调控相分离发挥药理作用提供了新概念框架，此前尚未有研究将相分离与芦丁的作用机制联系起来。然而该研究亦存在诸多局限性：芦丁与hnRNP L的结合亲和力为中等强度（KD≈19 μM），可能作用于多个靶点，观察到的抗纤维化效应可能反映多靶点的累积调节；IDR截短突变体在失去相分离能力的同时可能损害hnRNP L的其他功能域；未能直接原位观察肺纤维化组织中内源性hnRNP L的相分离；体外研究采用胎肺成纤维细胞系，可能无法完全模拟原代成体肺成纤维细胞或IPF患者成纤维细胞的行为；模型未纳入基质硬度等机械微环境因素；PKM2–乳酸–H3K9la回路各步骤的因果关系尚未最终确证；所有体内实验均来自单一批次动物队列；芦丁的口服生物利用度低、药代动力学特性尚待优化。

研究结论为：芦丁可能通过干扰hnRNP L相分离，调节PKM2可变剪接、乳酸生成和H3K9la介导的转录调控这一代谢–表观遗传回路，从而减轻肺纤维化。该机制将hnRNP L相分离与代谢–表观遗传调控联系起来，首次提出相分离可被天然小分子化合物药理学靶向，为纤维化疾病的治疗提供了新思路和潜在干预靶点。未来需要在更接近病理生理状态的原代细胞和多个独立动物队列中验证该模型，并通过化学修饰或纳米递送策略提高芦丁的生物利用度，以推动其临床转化。