海南直肠癌患者分离的产blaNDM-5碳青霉烯酶多重耐药单相鼠伤寒沙门菌ST34全基因组解析：抗生素耐药与毒力决定簇

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Multidrug-resistant monophasic Salmonella Typhimurium ST34 strain producing blaNDM-5 carbapenemase isolated from a patient with rectal cancer in Hainan, China: comprehensive whole genome dissection of antibiotic resistance and virulence determinants

　　

背景：研究人员报告了从一名免疫抑制直肠癌患者中鉴定并全面全基因组表征一株产新德里金属β-内酰胺酶5（New Delhi metallo-β-lactamase 5, NDM-5；编码基因bla_NDM-5）的多重耐药（multidrug-resistant, MDR）单相鼠伤寒沙门菌（monophasic Salmonella Typhimurium）ST34株SYA001。单相鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica subsp. enterica serovar 1,4,[5],12:i:-）是全球食源性胃肠炎和住院的主要致病菌之一，碳青霉烯耐药株的快速出现和传播严重削弱了临床治疗并构成重大公共卫生威胁。

方法：研究人员开展了一系列标准化表型试验，以表征SYA001的微生物学、生化和抗菌耐药谱。使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）、生化鉴定和玻片凝集血清分型进行菌种和血清型确证。使用VITEK 2 compact系统进行抗菌药物敏感性试验（antimicrobial susceptibility testing, AST），并通过胶体金免疫层析法（colloidal gold immunochromatographic assay）筛选六种碳青霉烯酶。在DNBSEQ-T7平台进行全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS），并应用综合生物信息学流程解析该菌株的基因组结构、系统发育特征、抗生素耐药决定簇、质粒谱、前噬菌体区域、沙门菌致病岛（Salmonella pathogenicity islands, SPIs）和蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络。

结果：结果证实SYA001为血清型1,4,[5],12:i:-单相鼠伤寒沙门菌，属于全球流行ST34克隆。该菌株表现MDR表型，对包括碳青霉烯类、头孢菌素类和氨基糖苷类在内的7类抗生素耐药，仅对氨曲南、阿米卡星、替加环素和黏菌素敏感。基因组分析鉴定出核心碳青霉烯耐药基因bla_NDM-5，以及多个共存耐药基因，包括bla_OXA-10、qnrS1、tet(A)、sul2和sul3等。检测到四个质粒复制子（IncHI2、IncHI2A、IncQ1、p0111）、15个前噬菌体区域和一套完整的毒力相关SPIs（SPI-1至SPI-5、SPI-9、SPI-13、SPI-14）。PPI网络分析显示AcrA是外排介导耐药调控网络的核心枢纽。

结论：本研究为来自一名免疫抑制直肠癌患者的产bla_NDM-5 MDR单相鼠伤寒沙门菌提供了基因组见解，补充了海南碳青霉烯耐药沙门菌的临床监测数据。

研究背景：沙门菌（Salmonella）为肠杆菌科（Enterobacteriaceae）革兰阴性杆菌，是人兽共患病原，可经动物或动物源性食品传人。非伤寒沙门菌（non-typhoidal Salmonella, NTS）引起急慢性胃肠炎；碳青霉烯类是严重革兰阴性菌感染的最后防线，碳青霉烯耐药NTS，尤其产新德里金属β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase, NDM）株，已成为全球临床和公共卫生挑战。鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）抗原式为(1,4,[5],12:i:1,2)，单相变体（monophasic Salmonella Typhimurium）抗原式为(1,4,[5],12:i:-)，缺乏第二相鞭毛抗原，多因fljB基因缺失等所致。ST19和ST34为优势流行谱系，ST34曾与污染巧克力相关跨国暴发。MDR单相鼠伤寒沙门菌在全球快速出现，中国腹泻患者检出率持续上升；但来自恶性肿瘤/免疫抑制患者的产bla_NDM-5 MDR单相鼠伤寒沙门菌基因组数据有限。因此，研究人员对海南三亚直肠癌患者粪便分离株SYA001进行全基因组解析，以补充海南碳青霉烯耐药沙门菌监测数据，为抗感染策略提供信息。

主要关键技术方法：菌株来源于海南三亚某医院一名直肠癌急性腹痛、严重腹泻患者粪便。采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）、VITEK 2 GN生化、玻片凝集血清分型、胶体金免疫层析筛选bla_KPC、bla_NDM、bla_IMP、bla_VIM、bla_OXA-48、bla_OXA-23，VITEK 2 compact测定25种抗菌药物最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations, MICs）。DNBSEQ-T7平台WGS，经组装、注释、核糖体多位点序列分型（ribosomal multilocus sequence typing, rMLST）/多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）、sistr_cmd、平均核苷酸同一性（average nucleotide identity, ANI）、数字DNA-DNA杂交（digital DNA-DNA hybridization, dDDH）、CD-HIT，以及PlasmidFinder、ResFinder、CARD、PHASTEST、SPIFinder 2.0和STRING PPI分析。

结果：
3.1 SYA001是一株产NDM的MDR菌株。通过SS琼脂菌落形态、MALDI-TOF MS、VITEK 2和血清凝集，SYA001确认为单相鼠伤寒沙门菌；胶体金示bla_NDM型碳青霉烯酶阳性，WGS预测为bla_NDM-5。药敏显示对氨基青霉素类、β-内酰胺酶抑制剂复方、头孢菌素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、四环素类和磺胺类等7类耐药，仅对氨曲南、阿米卡星、替加环素、黏菌素敏感，左氧氟沙星和环丙沙星中介，符合MDR。

3.2 SYA001基因组与功能分析。WGS数据6.15 G，46,750,342 reads，读长150 bp，GC 51.01%，Q20 97.14%，Q30 89.37%；clean reads 46,747,866。组装89个contigs，总长5,223,782 bp，N50 222,771 bp，GC 51.86%；注释4,923个CDS、139个misc_RNA、59个调控RNA、76个tRNA、3个rRNA。COG中3,903个CDS归入功能类，占79.3%，碳水化合物转运代谢最大（446个，9.1%）；mobilome 130个。KEGG中2,613个蛋白归入六大类，占53.1%，代谢占58.9%；235个与人疾病相关，其中细菌感染病32.8%、抗菌药耐药19.6%。

3.3 SYA001的计算机模拟沙门菌分型。rMLST将其归为Salmonella enterica，ST为ST34；sistr_cmd预测为单相鼠伤寒沙门菌；七个管家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、thrA支持MLST。与参考株Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2比较，ANI 99.85%，dDDH 99.6%，超过物种阈值；比对区平均核苷酸同一性99.96%，总体同一性99.91%，仅1,275个SNP，无大尺度染色体重排。CD-HIT得5,240个基因簇，4,301个共享；六个等位基因相同，仅dnaN不同（LT2 dnaN-7，SYA001 dnaN-19），与SYA001属ST34、LT2属ST19一致。SYA001特有的654个基因簇主要为获得性耐药基因、前噬菌体区和质粒相关移动元件，未检出核心毒力基因大缺失。

3.4 抗生素耐药基因及质粒介导耐药的预测与共定位分析。预测到IncHI2、IncHI2A、IncQ1、p0111四个质粒复制子；sul2与IncQ1位于同一contig，支持IncQ1介导磺胺耐药。鉴定三类耐药相关元件：17个获得性耐药基因、18个内在外排泵结构成分、7个转录调控基因；获得性耐药基因是MDR主要驱动因素。bla_NDM-5位于contig000040，IncHI2复制子预测在contig000011；bla_NDM-5所在contig含Tn125型复合转座子结构IS3000-ISAba125-IS5-bla_NDM-5-ble_MBL。与参考质粒CP162903.1（pST2742-1，246,818 bp）比对，13个SYA001 contigs可比对，≥500 bp且≥90%同一性片段骨架覆盖96.1%，≥2 kb片段覆盖89.7%，提示bla_NDM-5可能位于IncHI2型质粒；IS26在contig000086（612 bp，100%同一性）检出。多数耐药序列与外排泵介导耐药相关；EF-Tu和UhpT突变分别与elfamycin和fosfomycin耐药相关。ST34通常携带染色体ASSuT耐药岛，SYA001在此基础上获得质粒携带碳青霉烯耐药决定簇。

3.5 SYA001中的前噬菌体序列。基因组预测15个前噬菌体区：8个完整、5个不完整、2个可疑；全基因组4,986个基因中393个为前噬菌体相关基因，4,593个为细菌基因，完整区含头、尾、衣壳、终止酶、整合酶等结构/调控基因。

3.6 SYA001中的沙门菌致病岛。SPIFinder 2.0检出SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5、SPI-9、SPI-13、SPI-14及C63PI铁摄取岛和CS54岛。SPI-1含invA、prgH、prgI、prgJ、hilD、sipD等，参与Ⅲ型分泌系统（type III secretion system, T3SS）组装和侵袭；SPI-2含ssa系列及ssrA、ssrB等，与胞内存活相关。

3.7 抗生素耐药相关蛋白的蛋白-蛋白相互作用网络。基于STRING数据库预测，AcrA为耐药调控网络中心枢纽，与AcrB（组合评分0.999）及TolC、AcrD、AcrF等形成多种耐药结节细胞分化（resistance-nodulation-cell division, RND）外排系统核心支架；MarA、BaeR、BaeS、CRP等转录调控因子与外排基因广泛连接。基因组互作分析提示bla_NDM-5与RND外排泵可能存在协同耐药模式，需实验验证。

讨论部分：研究人员将SYA001确认为单相鼠伤寒沙门菌ST34，ST34是自20世纪90年代西班牙出现后全球传播的高流行克隆，具有高传播能力和多途径传播。与LT2的ANI和dDDH证实分类。中国单相鼠伤寒沙门菌检出率上升，多数地区MDR率超过70%，但产bla_NDM-5碳青霉烯耐药株仍相对少见，故SYA001对耐药沙门菌监测重要；从直肠癌患者分离也提示免疫抑制人群可能是新发碳青霉烯耐药沙门菌高风险宿主。药敏与耐药基因型总体一致。bla_NDM-5是NDM家族高活性变体，可水解包括亚胺培南、美罗培南、厄他培南等几乎所有β-内酰胺类，导致碳青霉烯耐药；该菌仍对黏菌素、替加环素敏感，为治疗保留选择，但需监测mcr等黏菌素耐药决定簇。bla_NDM在沙门菌中较肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌少见，且多为bla_NDM-1，bla_NDM-5少见；bla_NDM-5有Val88Leu和Met154Leu替换，水解碳青霉烯活性更高、底物谱更广，并降低对经典β-内酰胺酶抑制剂敏感性。除bla_NDM-5外，SYA001还携带bla_OXA-10、qnrS1、tet(A)、sul2/sul3及多种氨基糖苷类灭活基因等；EF-Tu和UhpT突变分别关联elfamycin和fosfomycin耐药。IncHI2质粒是肠杆菌科bla_NDM传播关键载体，IncQ1携带sul2。短读长测序可能因重复序列和插入元件将大质粒片段化，导致bla_NDM-5与IncHI2复制子位于不同contig，并不代表bla_NDM-5真实不在IncHI2骨架。PPI显示AcrA核心枢纽，AcrAB-TolC等外排系统及MarA、BaeR、CRP调控网络可能协同增强耐药。SPIs完整，SPI-1和SPI-2核心毒力决定簇提示侵袭和胞内存活潜力；C63PI和CS54岛参与体内存活和肠道定植。前噬菌体丰富提示基因组可塑性。研究人员指出局限：单中心单株、无流行病溯源；短读长不能解析完整环状质粒，需长读长和接合实验；未做体外细胞感染和体内动物实验；毒力和耐药机制主要基于基因组预测。

研究结论翻译：总之，研究人员报道了中国海南一名直肠癌患者中产bla_NDM-5 MDR单相鼠伤寒沙门菌ST34分离株的首次基因组特征。该菌株属于全球流行ST34克隆，携带一整套保守毒力基因元件，并已获得包括碳青霉烯酶在内的多种抗菌耐药决定簇。本研究为碳青霉烯耐药沙门菌的临床监测提供了重要基因组数据，并强调高危ST34谱系中抗菌耐药性的持续进化。