牛蒡根提取物对丙戊酸诱导的肝胰毒性的保护作用：生化、组织病理学及免疫组织化学分析

《Frontiers in Pharmacology》：Hepatoprotective and pancreatoprotective effects of Arctium lappa root extract in valproic acid–induced toxicity: biochemical, histopathological, and immunohistochemical analysis

　　

引言： 丙戊酸（VPA）是一种广泛使用的抗癫痫药物；然而，其临床应用受到肝毒性和胰腺炎的限制，这主要通过氧化应激和炎症介导。据报道，牛蒡（Arctium lappa）根提取物（ALRE）具有抗氧化、抗炎和细胞保护特性，可能对VPA诱导的器官毒性提供保护。 方法： 研究人员采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高效液相色谱（HPLC）对ALRE进行植物化学分析。通过MTT法评估了ALRE在Hep3B和PANC-1癌细胞系中的体外细胞毒性效应，以及在THLE-2正常肝上皮细胞和H6C7正常胰腺导管上皮细胞中的安全性。研究人员在雄性Wistar白化大鼠的VPA诱导毒性模型中，通过生化、氧化应激和组织病理学分析，研究了ALRE的肝脏保护和胰腺保护作用。 结果： ALRE对THLE-2和H6C7细胞表现出低细胞毒性，半数抑制浓度（IC50）值分别为1,084.92和1,174.62 μg/mL。与对照组相比，VPA给药显著升高了血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）（127.67 ± 4.34 U/L）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）（153.67 ± 4.91 U/L）、碱性磷酸酶（ALP）（178.67 ± 5.21 U/L）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）（7.67 ± 0.09 U/L）、淀粉酶（47.33 ± 2.91 U/L）和脂肪酶（49.00 ± 3.79 U/L）的水平（p < 0.05）。这些酶水平，尤其是在500 mg/kg剂量下，被ALRE显著降低。此外，ALRE恢复了抗氧化防御系统（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和还原型谷胱甘肽（GSH）），降低了丙二醛（MDA）水平，并改善了肝脏和胰腺的组织学结构。 结论： ALRE通过抗氧化和细胞保护机制有效减轻了VPA诱导的肝脏和胰腺损伤，同时对正常的肝脏和胰腺细胞表现出极低的毒性。这些发现支持了牛蒡作为天然保护剂对抗VPA相关肝毒性和胰腺炎的潜在治疗应用。有必要进一步研究阐明ALRE保护作用背后的分子机制和药代动力学相互作用。

研究背景与目的

癫痫是一种常见的神经系统疾病，常需长期使用抗癫痫药物治疗。丙戊酸（VPA）作为一种广谱抗癫痫药物，也用于双相情感障碍和偏头痛预防等适应症。尽管VPA临床疗效确切，但其严重的副作用——尤其是肝毒性和急性胰腺炎——限制了其广泛应用。VPA在肝脏中广泛代谢，产生如4-烯-VPA和2,4-二烯-VPA等有毒代谢产物，这些产物会诱导线粒体功能障碍、氧化应激和炎症反应，最终导致肝脏和胰腺损伤。目前虽有左卡尼汀等药物被研究用于缓解VPA毒性，但寻找更安全有效的天然保护剂仍是研究热点。牛蒡（Arctium lappa）作为一种传统草药，富含菊粉、木脂素、多酚和黄酮类化合物，已被证实具有保肝、抗炎和抗氧化等多种药理活性。然而，尚无研究评估牛蒡根提取物（ALRE）对VPA所致肝胰损伤的保护作用。基于此，本研究旨在通过生化、组织病理学和免疫组织化学方法，在大鼠模型中评估ALRE对VPA诱导的肝毒性和胰腺炎的防护效果。

主要技术方法

研究人员首先通过索氏提取法制备不同溶剂的ALRE，并选择产率和活性最优的50%甲醇水（v/v）提取物进行研究。采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高效液相色谱（HPLC）对ALRE进行植物化学成分初步鉴定。通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基清除实验评估其体外抗氧化活性。使用MTT法检测ALRE对人肝癌Hep3B细胞、人胰腺癌PANC-1细胞以及正常人肝上皮THLE-2细胞和正常人胰腺导管上皮H6C7细胞的细胞毒性。动物实验选用雄性Wistar白化大鼠，通过连续28天口服给予VPA（300 mg/kg）建立毒性模型，同时联合给予低剂量（300 mg/kg）或高剂量（500 mg/kg）的ALRE或阳性对照药左卡尼汀（300 mg/kg），评估其保护作用。检测指标包括血清肝功能标志物（ALT、AST、ALP、GGT）和胰腺酶（淀粉酶、脂肪酶），肝胰组织的氧化应激标志物（SOD、CAT、GSH、MDA），并通过苏木精-伊红（H&E）染色进行组织病理学检查，通过免疫组织化学染色检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的表达。

研究结果

3.1 提取率、植物化学表征及植物化学活性

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  得率（%）： 50%甲醇水（v/v）提取物的得率最高（12.80%），其次为纯甲醇提取物（10.23%），水提物得率最低（4.27%）。
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  GC-MS分析： 初步鉴定了O-甲基异脲、3,4-二氢-6-甲氧基-1(2H)-萘酮等6种主要挥发性成分。
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  HPLC分析： 在280 nm检测波长下共检出17个峰，其中保留时间5.013分钟的主峰面积占比达69.94%，初步鉴定为牛蒡的主要活性木脂素——牛蒡苷。
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  总黄酮含量（TFC）： 50%甲醇水提取物的TFC最高（19.93 mg QE/g干根）。
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  总酚含量（TPC）： 50%甲醇水提取物的TPC最高（21.36 mg GAE/g干根）。

3.2 体外抗氧化活性

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  DPPH自由基清除活性： 50%甲醇水提取物表现出最强的DPPH清除能力，IC₅₀值为370.70 μg/mL，但仍弱于标准品丁基羟基甲苯（BHT）（IC₅₀ = 310.11 μg/mL）。
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  ABTS⁺自由基清除活性： 纯甲醇提取物表现出最强的ABTS清除能力，IC₅₀值为370.43 μg/mL，但弱于标准品维生素C（IC₅₀ = 334.31 μg/mL）。

3.3 癌细胞系（Hep3B和PANC-1）的细胞活力测定

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  在25-500 μg/mL浓度范围内，ALRE对两种癌细胞均显示出极低的细胞毒性，细胞活力维持在90%以上。在高浓度（750-1250 μg/mL）时，细胞活力呈浓度依赖性下降。ALRE对Hep3B和PANC-1细胞的IC₅₀值分别为1,184.46 μg/mL和1,234.11 μg/mL，表明其细胞毒性较低。

3.4 正常细胞系（THLE-2和H6C7）的细胞活力测定

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  ALRE对正常肝上皮THLE-2细胞和正常胰腺导管上皮H6C7细胞的IC₅₀值分别为1,084.92 μg/mL和1,174.62 μg/mL，显示出良好的安全性。

3.5 ALRE对大鼠体重、肝脏指数和胰腺指数的影响

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  VPA组大鼠的体重、肝脏指数和胰腺指数均显著高于对照组。ALRE（尤其500 mg/kg高剂量）和左卡尼汀均能显著改善这些VPA引起的异常变化。单独给予ALRE未观察到不良影响。

3.6 ALRE对肝酶和胰腺酶的影响

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  VPA组大鼠血清ALT（127.67 U/L）、AST（153.67 U/L）、ALP（178.67 U/L）、GGT（7.67 U/L）、淀粉酶（47.33 U/L）和脂肪酶（49.00 U/L）水平均较对照组显著升高。ALRE（尤其500 mg/kg）和左卡尼汀均能显著降低这些升高的酶水平。

3.7 ALRE对氧化应激标志物的影响

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  VPA组大鼠肝脏和胰腺组织中SOD和CAT活性、GSH水平显著降低，而脂质过氧化产物MDA水平显著升高。ALRE（尤其500 mg/kg）和左卡尼汀均能显著逆转这些改变，即提高抗氧化酶活性和GSH水平，降低MDA水平。

3.8 组织病理学检查

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  对照组大鼠肝胰组织结构正常。VPA组肝脏出现明显的肝细胞肿胀、空泡变性和坏死，胰腺出现腺泡细胞萎缩、坏死和炎症浸润。ALRE（尤其500 mg/kg）和左卡尼汀治疗后，肝胰组织的病理损伤明显减轻，组织结构得到改善。

3.9 免疫组织化学染色

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  VPA组大鼠肝脏和胰腺组织中促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的表达显著增强。ALRE（尤其500 mg/kg）和左卡尼汀均能显著下调这两种炎症因子的表达水平。

总结与讨论

本研究首次系统评价了牛蒡根提取物（ALRE）对丙戊酸（VPA）诱导的肝毒性和胰腺炎的保护作用。研究结果表明，VPA可导致大鼠肝功能指标（ALT、AST、ALP、GGT）和胰腺酶（淀粉酶、脂肪酶）显著升高，引发严重的氧化应激（SOD、CAT、GSH降低，MDA升高）和组织病理学损伤，并上调肝脏和胰腺组织中TNF-α和IL-1β的表达。而ALRE干预，特别是500 mg/kg的高剂量，能够有效降低这些升高的血清酶水平，恢复机体抗氧化防御能力，减轻脂质过氧化，改善肝胰组织形态结构，并抑制炎症因子的表达。这些保护作用的机制可能与ALRE中丰富的酚类和黄酮类化合物（如牛蒡苷等）所具有的强效抗氧化和抗炎活性密切相关。研究还证实，ALRE在体外对正常肝细胞和胰腺细胞毒性极低，且在体内单独使用时未见不良影响，显示其具有良好的安全性。本研究的结论是：ALRE通过抗氧化和细胞保护机制有效减轻了VPA诱导的肝脏和胰腺损伤，同时对正常的肝脏和胰腺细胞表现出极低的毒性。这些发现支持了牛蒡作为一种天然保护剂对抗VPA相关肝毒性和胰腺炎的潜在治疗应用。有必要进一步研究阐明ALRE保护作用背后的分子机制和药代动力学相互作用。